无血清两步法脐血巨核祖细胞体外扩增及诱导成熟的研究-论文

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1、无血清两步法脐血巨核祖细胞体外扩增及诱导成熟的研究*论文.freelentaneethodtogetmanyCB-derivedmegakaryocytesfromcordbloodmononuclearcells(MNCs)forclinicalresearch.MethodsFirst，cordbloodMNC-freemediumbyatbersofMNCs，CFU-MKsandCD41+cellseasuredatday0，6，10，14and18.MorphologyanalysisepointofmaximalCFU-MK，MNC，CD41+cellsnumb

2、erisatday10，18and18.ThenumberofCFU-MK，MNC，CD41+cellsexpanded6.8，4.8and44foldrespectively.Atday18，50%～74%maturemegakaryocytescanbeidentifiedbymorphologyinthenucleatedcells.94%～96%ofthemegakaryocytesaregranularmegakaryocytesandthrombocytogenousmegakaryocytes.ConclusionInvitro，egakaryoctesde

3、rivedfromcordbloodintheneethod.【Keybilicalcordblood；mononuclearcell；serum-freeculture；megakaryocyte；mature脐血造血干细胞移植后血小板恢复时间延迟是困扰临床的一大难题，大量研究表明，这主要与脐血中巨核祖细胞数量不足及脐血巨核细胞分化成熟障碍有关［1］。其中，脐血巨核细胞为何会出现分化成熟障碍已成为目前研究的热点之一。而大量的脐血巨核细胞为进一步研究所必需，笔者为体外获取大量的脐血巨核细胞建立了一个新的较简便、有效的培养方法，为进一步研究提供了平台。在国内未见相关报道。现

4、报道如下。1材料与方法1.1研究对象以从足月正常分娩的健康产妇脐静脉采集的脐血MNC为研究对象，脐血由广州医学院附属广州市第一人民医院妇产科提供。1.2主要试剂HES（含6%羟乙基淀粉的0.9%氯化钠注射液）购自美国B.Braun公司。淋巴细胞分离液购自中国医学科学院血液研究所。TPO、IL-3、SCF、IL-6均购自英国PeproTech公司。无血清培养液使用StemSpanTMSFEM，巨核系祖细胞集落（CFU-MK）培养及鉴定体系使用MegaCultTM-C试剂盒，均购自加拿大StemCellTechnologies公司。1.3MNC的分离采集足月妊娠的健康产妇脐血

5、，以肝素抗凝（20u/ml），脐血采集量40～60ml，共采集6例，采集后2h内进行分离处理。以淋巴细胞分离液分离MNC后，以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次。按1×107/ml细胞浓度加入无血清培养液StemSpan，在5%CO2、37℃及饱和湿度条件下在6孔培养板中孵育2h，以去除粘附细胞及残余血小板。孵育后，取出去粘附后MNC，用PBS100g洗涤1次后备用。1.4细胞的培养接种将去粘附后MNC按1×106/ml接种于无血清培养液StemSpan中，在StemSpan中加入青霉素（100u/ml）、链霉素（100μg/ml）及细胞因子。按细胞因子组合的不同分组如下：阴

6、性对照组、细胞因子组。细胞因子终浓度为：TPO50ng/ml，IL-320ng/ml，SCF50ng/ml，IL-620ng/ml。培养体系接种于50ml培养瓶中，每瓶液体总量为6ml，在5%CO2、37℃及饱和湿度条件下培养18天，第6、10天进行1/3量换液，加入新鲜培养液及相同浓度的细胞因子。在第14天进行1/3量换液，仅加入相同浓度的TPO、IL-6延长培养至第18天。1.5MNC、CD41+细胞、CFU-MK的检测在培养的0、6、10、14、18天取出细胞行MNC数、流式CD41+细胞比例及CFU-MK的检测。MNC为人工计数，CD41+细胞比例由流式细胞仪检测

7、，而CFU-MK用MegaCultTM-C试剂盒进行检测。1.6培养后脐血巨核细胞的形态学分析延长培养至18天时，将培养后细胞离心涂片、风干，加入瑞氏染液染色，然后，在显微镜下观察培养后有核细胞中脐血成熟巨核细胞的比例、形态学特点及产板情况。1.7统计学分析实验数据以x±s表示，所有数据均采用SPSS软件分析，统计方法为ANOVA，P0.05为差异有显著性，P0.01为差异有非常显著性。2结果见表1。表1细胞因子组对脐血MNC、CFU-MK、CD41+细胞的扩增作用（x±s，n=6）在6、10、14天，因子组的MNC总数、CF