血管紧张素ⅱ对脐血红系造血祖细胞优势扩增的分析

《血管紧张素ⅱ对脐血红系造血祖细胞优势扩增的分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、些堕墨型盔主堡主芏壁堡墨I组GM—CSF+IL一3+SCF+EPOII组GM—CSF+IL一3+SCF十EPO+AngIIIⅡ组GM-CSF+IL-3+SCF+AngIIⅣ组GM—CSF+IL一3+SCF选5ml×12孔培养瓶4孔，按分组要求加入刺激因子：人重组IL一350ng／ml，SCF50ng／ml，GM—CSF20ng／ml、EPO3U／ml以及Ang110，lumol／L。调整细胞浓度取4份l×105个细胞接种到无血清悬浮培养基中，培养体系总体积2ml／孑g。在5％C02、37。C饱和湿度的培养箱中培养14天。每3天半量更换一次培养液，同时加入相应的刺激因子，每1

2、2小时加一次AngII。在0、3、6、9、12天从各组培养体系中提取l×105个细胞，用于提取RNA。培养9天后各提取l×i04个细胞接种到4孔／ml半固体培养基进行集落分析、计数。2．2．3RT—PCR检测ATIRmRNA的表达细胞总RNA的提取：(1)取501．1悬浮培养细胞液(含1×105个细胞)，加入到1．5mlEP管中，加细胞裂解液501-I，上下摇匀50次左右，放置5—10分。(2)加入50“LDNA-protein沉淀液，上下摇匀50次，-20。C放置5—10分钟，12000转离心5分钟。(3)取上清放入另一EP管(加入300扯i异丙醇)，摇匀12000转离心

3、3分钟。(4)去上清，放入70％乙醇300斗I，摇匀，离心3分钟。(5)倒掉上清，自然干燥(10分钟)加DEPC水20p卜70。C冻存。逆转录(cDNA的合成)：取2ulRNA产物，依次加入0．1“g随机引物、lOmmol／L4XdNTPl．5且1、5×缓冲液2．5ul、去离子水10．5u1，混匀，65℃水浴5分钟，加入20URNasin，200UM-MLv逆转录酶，反应总体积40ul，混匀，37。C孵育1h，然后72。C水浴lOmin后停止反应，逆转录反应产物保存于一209C冰箱备用。山西医科大学硕士学位论文POR仪扩增目的基因。第一个反应体系：引物序列：上游序列ATl一

4、F5’一TTTAGcACTGGCTGAcTTATG一3’下游序列ATI—R5一AGAAAAGGAAACAGGAAACCCA一3’反应体系：模板(逆转录产物)5u1，10×缓冲液2．5pl，10mmol／L4×dNTPI．5“l，引物各1．5“l，去离子水10．5“I，M92’I．5p1，再加入1ulTaq酶混匀，总体积为25ui。反应条件：95。C2分钟变性，95。C50秒56"C50秒72。C50秒延伸35个循环，72℃10分钟退火。第二个反应体系：引物序列：ATI—FN5一TTAcTGACTTTGccAcTATG一37AT卜RN5一CAT从TGGAAAGCACA从CT一

5、3’反应体系：模板(第一个反应体系的扩增产物)5ul，其余成分同第一个反应体系。反应条件：同第一个反应体系。0一actin(内参)的扩增：引物序列：上游引物5一ACACTGTGCCCATCTACGAGG一3’下游引物5一AGGGGCCGGACTCGTCATACT一3。反应体系：模板(逆转录产物)5u1，其余条件同第一个反应体系。反应条件：同第一个反应体系。ATIR扩增片段长度3[Obp，p—actin的扩增片段长度621bp。扩增产物在lOOml琼脂糖凝胶电泳中跑胶，15u1EB染色，紫外灯下观察结果并照相，根据内参照信号校正基因产物信号。2．2．4半固体集落培养培养体系为

6、甲基纤维素半固体培养基(StemCellTechnologies公司)，其中含SCF50ng／ml，IL一320ng／ml，GM—CSF20ng／m1．EPO3U／ml，和lX104个／ml的悬浮培养细胞，在5％C02，37。C饱和湿度的培养箱中培养14天后进行集落计数。以含3个以上细胞簇，大于或等于50个血红蛋白化的红系山西医科大学硕士学位论文祖细胞族的集落为标准计为1个BFU—E，含有多于50个粒细胞或巨噬单核细胞的集落计为1个CFU—GM。BFU-E集落在接种6—8天后于倒置显微镜下观察、用联苯胺染色”1后(红系集落染成蓝色至棕黄色)计数，GM—CSF集落在接种8一1

7、0天后于倒置显微镜下观察、计数。联苯胺配制方法：苯胺0．19溶于含0．5mot／L乙酸，0．1％也02的PBS液50mL中，终浓度为0．296。2．2．5流式细胞术检测红系、粒系细胞将各组集落细胞用lXPBS液冲洗并收集细胞调整浓度为l×104个／ml，分别O．111g抗CD59、CD33的抗体标记红系、粒系细胞30分钟后，用流式细胞仪检测红系、粒系细胞。2，3统计学分析数据采用SAS8．2软件包处理，应用单因素随机设计的方差分析方法，计量资料的描述用均数±标准差，组间比较用方差分析，组间两两比较应用SNK法。所有