hlif转基因饲养层细胞对脐血cd34272b造血干2f祖细胞增殖和分化的影响

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1、hLIF转基因饲养层细胞对脐血CD34+造血干，祖细胞增殖和分化的影响中文摘要目的：分别建立逆转录病毒载体和腺病毒载体介导的转人白血病抑制因子(humanleukemiainhibitoryfactor,hLIF)基因饲养层细胞，体外观察转基因细胞对CD34+造血干／祖细胞增殖和分化的影响，体内研究对辐射损伤SCID小鼠造血功能恢复的效果。方法：将本科室构建和保存的hLIF基因重组逆转录病毒载体经鉴定正确后转染293T人胚肾成纤维细胞，经抗生素Zeocin筛选后获得稳定的转基因饲养层细胞，采用RT-PCR法和ELISA法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测hLIF基因

2、在饲养层细胞中的转录和翻译；将本科室保存的重组腺病毒Ad．hLIF感染WI．38人胚肺成纤维细胞建立饲养层细胞，同样采用RT-PCR法和ELISA法检测hLIF基因的表达；采用免疫磁珠法分离脐带血CD34。+造血干／祖细胞，流式细胞术检测其纯度；将CD34+造血干／祖细胞分别与上述饲养层细胞共培养，流式细胞术检测各组增殖效果；扩增后的造血细胞经CFDASE(Carboxyfluoresceindiacetate，succinimidylester，)荧光标记后移植入辐射损伤SCID小鼠体内，通过细胞荧光标记法和RT-PCR法检测小鼠骨髓内含Alu基因人源细胞的归巢情

3、况。结果：建立的逆转录病毒载体介导转hLIF基因饲养层细胞经Zeoein筛选后均带有绿色荧光，RT-PCR法和ELISA法鉴定hLIF基因可以在293T细胞中有效表达；50MOI的重组腺病毒Ad-hLIF感染WI．38细胞48h后，可见95％以上的细胞均有绿色荧光，RT-PCR法和ELISA法鉴定转基因细胞中有hLIF基因的表达：免疫磁珠法分离的CD34+造血干／祖细胞经流式细胞术检测其纯度可达95．6士2．58％，与逆转录病毒载体介导的转hLIF基因饲养层细胞共培养7d后，细胞总数最高可扩增12．6士1．32倍，表面粘附分子CXCR4和CD54表达量分别为55．0

4、％、59．3％；而Ad．hLIF转基因饲养层细胞可使CD34+造血干／祖细胞7d内扩增18．454-1．24倍，表面粘附分子1hLIF转基因饲养层细胞对脐血CD34+造血千，祖细胞增殖和分化的影响中文摘要CXCR4和CD54表达量分别为57．2％、59．8％，继续培养28d后，细胞总数扩增了356．95-4-0．87倍，其中CD34+细胞的数量出现了动态变化，在0～14d能维持较高水平，最高可扩增52．11+1．13倍，以后逐渐降低，共培养28d时，CD34+细胞数量仍比共培养前有较大升高，可扩增13．92士0．85。将扩增后的造血细胞移植辐射损伤SCID小鼠后，可

5、明显提高小鼠存活率，4周内小鼠骨髓中不仅可观察到CFDASE荧光标记的细胞，而且经RT-PCR法鉴定后，还可检测到表达Alu人源基因的人脐血造血归巢细胞。结论：成功建立了逆转录病毒载体介导的转hLIF基因饲养层细胞和Ad．hLIF转基因饲养层细胞，不仅体外可以有效的扩增CD34+造血干／祖细胞，并延缓其分化，而且扩增的CD34+细胞对辐射损伤SCID小鼠具有一定的造血恢复功能。关键词：人白血病抑制因子：逆转录病毒载体；腺病毒载体；造血干／祖细胞：SCID小鼠II作者：井莹莹指导教N-缪竞诚教授杨吉成教授hLIF转基因饲养层细胞对脐血CD34+造血干／祖细胞增殖和分化

6、的影响英文摘要TheEffectofhLIFTransgenicFeederLayerCeilsonProliferationandDifferentiationofUmbilicalCordBloodCD34+HSPCAbstractObjective：Toestablishretroviralvectorofhumanleukemiainhibitoryfactor(hLIF)geneandAd—hLIFtransgenicfeedercells，respectively,whichwereusedfortheexpansionofumbilicalcordbl

7、oodCD34+HSPCinvitroandstudytheSCIDmicemodelofHSPCtransplantation．Methods：RecombinantretroviralvectorofhLIFgeneconstructedinourlaboratorywastransfectedintohumanembryokidneyfibroblastscellline293TbyLipofectaminereagent，andthetransgeniccellsstainsexpressedhLIFwasobtainedinthemediumwhich