环介导等温扩增技术(lamp)与荧光定量pcr检测布鲁菌方法的建立及对比试验

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1、分类号S852.4学校代码10129UDC579学号2009201106环介导等温扩增技术(LAMP)与荧光定量PCR检测布鲁菌方法的建立及对比试验EstablishmenandComparativeofLAMPandFluorescentQuantitativePCRforBrucellaDetection申请人：张利学科门类：农学学科专业：临床兽医学研究方向：家畜内科学指导教师：莫内教授崔步云研究员论文提交日期：二〇一二年四月内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

2、据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：导师指导研究生学位论文的承诺本人承诺：我的研究生所呈交的学位论文是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现任岗位职务工作的结果，并严格按照国家及学校有关学术道德规范的规定要求而获得的研究结果。如果违反，我必须接受按国家及学校有关规

3、定的处罚处理并承担相应导师连带责任。指导教师签名：日期：内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：

4、摘要为快速、准确、便捷的检测和鉴定布鲁菌，本研究依据荧光定量PCR技术和环介导等温扩增技术（LAMP）的原理分别设计引物，建立了两种布鲁菌的检测方法并对其进行了评价。荧光定量PCR方法依据布鲁菌保守基因BCSP31设计探针和引物，LAMP方法创新性的运用布鲁菌多拷贝的插入序列IS711设计引物。试验用构建的质粒标准品对体系进行优化，确定两种方法的检测下限即灵敏度；将与布鲁菌有血清学交叉反应和种源相近的菌株DNA作为对照评价了两种方法的特异性。为保证标本的阳性检出率，本研究用荧光定量PCR技术分别对布鲁菌病患者的全血和血清中布鲁菌DNA进行了

5、检测，这也是国内首次将血清标本用于布鲁菌的分子生物学方法检测。试验结果显示，血清标本比全血更适合作为布鲁菌的分子生物学检测用标本。通过比较，荧光定量PCR2和LAMP技术均表现出较高的特异性，灵敏度都在10copy／uL的数量级水平上。在对50株布鲁菌地方菌株的鉴定中，荧光定量PCR、常规PCR以及LAMP方法与传统方法的鉴定结果符合率均为100％。而在临床血清标本的检测中，其阳性检出率分别为89％、62％和93％。对照菌株和血清的阴性符合率为100％。试验表明，两种方法用于布鲁菌病的临床诊断都具有较高的使用价值。综合考虑，前者因需要特殊仪

6、器和要求较高的实验室环境因此更适用于对数据要求较高或需要对模板进行定量的研究，而后者因不需要专用的设备仪器，更适合用于布鲁菌病流调现场或基层卫生防疫。关键词：布鲁菌；荧光定量PCR；LAMP；细菌鉴定；评价EstablishmenandComparativeofLAMPandFluorescentQuantitativePCRforBrucelladetectionAbstactTodetectandidentifybrucellainarapid,accurateandconvenientmanner,weestablishedandev

7、aluatedtwomeasures--FluorescencequantitativePCRandLAMPtechnologyusingdifferentprimersaccordingtotheprinciplesofeachmethod.BasedontheconservativegeneBCSP31ofbrucella,Fluorescencequantitativepolymerasechainreaction(PCR)probeandprimersaredesigned.LAMPusesauniquemethodtodesign

8、primersthroughbrucellainsertingsequenceIS711,whichisamuLti-copygene.Thereactionsystemisop