菜青虫酚氧化酶原编码基因的分子克隆及其表达研究

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1、山东农业大学硕士学位论文菜青虫酚氧化酶原编码基因的分子克隆及其表达研究姓名：李滨申请学位级别：硕士专业：农药学指导教师：薛超彬20120615山东农业大学硕士学位论文摘要酚氧化酶(phenoloxidaso，EC．1．14．18．1，简称PO)是一种重要的酶类，广泛存在于无脊椎动物、脊椎动物、植物、细菌和真菌等生物体内，在昆虫变态发育和免疫系统中起着重要作用，主要功能可总结为：(1)参与表皮的硬化和黑化；(2)对卵壳的鞣化作用；(3)参与伤害防御；(4)加速伤口的愈合等，是一种潜在的靶标酶。本文通过RT．PCR和RACE技术，克隆得到了编码菜青虫(Pier

2、israpae)酚氧化酶原的两个基因Prophenoloxidase．1(PrPPOI)和Prophenoloxidase一2(PrPP02)，并对序列信息进行了分析；并通过Semi．QuantitativeRT．PCR和QuantitativeReal．timePCR研究了PP01和PP02在菜青虫不同发育时期的表达情况；并用白僵菌制剂注射菜青虫5龄幼虫，研究白僵菌分生孢子对菜青虫PPO转录活性的影响，同时使用两种典型的PO抑制剂——槲皮素和曲酸，对菜青虫5龄幼虫进行了处理，测定了处理后4h、8h和12h时PP01的表达情况。研究结果如下：1．PrPP0

3、1全长eDNA序列有3338bp，包含一个2049bp的开放阅读框(ORF)，一个63bp的5’非编码区(5'UTR)和一个1226bp的带有加尾信号的3’非编码区(3’UTR)。开放阅读框从第“个核苷酸开始，终止于第2102个核苷酸，由其推导的氨基酸序列以甲硫氨酸为起始氨基酸，长为682个氨基酸，分子量为78．57kDa，估测等电点pI为6．37。2．PrPP02部分eDNA序列有1679bp，包含一个1173bp的开放阅读框(ORF)和一个506bp的带有加尾信号的3’非编码区(3’UTR)。开放阅读框从第1个核苷酸开始，终止于第1173个核苷酸，由于

4、该片段为部分eDNA，其他相关参数不做预测。3．PrPP01基因的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫PPOl基因具有较高的同源性(69．730／o-73．15％)；PrPP02基因的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫PP02基因具有较高的同源性(70．0％02．0％)。4．PrPP01和PrPP02各均具有两个高度保守的铜离子结合位点，及位于铜离子结合位点内的6个保守的组氨酸残基，此外，P#P01还包含一个类似于脊椎动物的a．巨球蛋白的硫羟酸酯区域。PrPP01与PrPP02的N端均不含信号肽，不存在跨膜结构域。5．P#P01中，a．螺旋占17．16％，随机卷曲63．20

5、％，它们是PrPP01最大量的结构元件，延伸链占19．65％，散布在整个蛋白质中，无p转角存在，同源建模显示PrPP01三级结构均为“a／13型"中的“滚筒结构"。菜青虫酚氧化酶原编码基因的分子克隆及其表达研究6．PrPP01在成虫中的表达量设定为1．0，PrPP01在卵和4龄幼虫中表达量最高，表达量分别为2．76和5．60；PrPP01在5龄幼虫和蛹中表达量较低，为0．2l和0．26；在l龄、2龄、3龄幼虫中，PrPP01的表达量比较接近，分别为2．16、1．82和1．52。PrPP02在成虫中的表达量设定为1．0，PrPP02在4龄幼虫中表达量最高，表

6、达量为13．24；卵和3龄幼虫次之；PrPP02在5龄幼虫中表达量较低，为O．96；在l龄和2龄幼虫中，PrPP01的表达量比较接近，分别为2．98和2．65；预蛹和蛹比较接近，分别为1．91和1．42。通过Real．timePCR和RT．PCR比较PrPPO表达量变化结果非常相近。7．白僵菌接种试验中，侵染组和对照组(PBS)在6h-12h之间PrPP01的表达量均有大幅度的升高，在12h的表达量分别为6h的5．67倍和5．0倍。而在12h后直至24h，PrPP01的表达水平开始回落，且在整个实验过程中侵染组和对照组(PBS)PrPP01的表达水平差距不

7、明显，．说明白僵菌侵染菜青虫对PPO影响甚微。8．在不同浓度的槲皮素和曲酸注射菜青虫的条件下，PrPP01的转录活性抑制不明显。关键词：菜青虫；酚氧化酶；昆虫免疫；荧光定量P保；人工接种n山东农业大学硕士学位论文AbstractPhenoloxidasefEC．1．14．18．1，PO)isakeyenzymewhichiswidelydistributedin-vertebrataandinvertebrataanimals，plants，bacteriaandfungus．Ininsects，POwasuniquelyassociated、Ⅳi血sev

8、eraldifferentphysiologieallyimpor