茶叶多酚氧化酶基因的克隆及微生物表达

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1、摘要茶叶多酚氧化酶基因的克隆与微生物表达专业名称：细胞生物学申请人：吴贻良导师姓名：李海航教授茶叶多酚氧化酶(polyphenolOXidase，PPO)在茶叶的加工过程中起着重要的作用，它影响茶叶的颜色，品质，茶叶功能物质诸如茶黄素和茶红素等的合成。茶PPO在医药，服装行业也有重要作用，然而，PPO资源的短缺限制了它的工业使用范围。本研究从中国五大名茶(云南大叶茶，安徽祁门红茶，杭州龙井茶，湖南湘波绿茶，福建铁观音茶)的核DNA中克隆出全长PPO基因，研究了PPO基因结构与功能关系以及其在原核和真核生物中的表达。主要研究结果如下：(1)．PPO基因克隆以及结构。从中国五大名茶茶树(CameI

2、liasine?ISisf1，．Longjing，cV．Qihong，CV．XiangbolV，cV．TieguanYin，cv．Ptiel")的核DNA中，PCR克隆出它们的全长PPO基因，测定序列(NCBl登录号为：EF635860，EF650016，EF65017，EF623826，GQl29l42)。五个茶树品种的PPO基因全长均约1．8kb，没有内含子，编码一个约含600个氨基酸，分予量约66KDa的单体。蛋白质序列包含一个约l00个氨基酸的华南师范人学硕卜学f节论文前导肽，以及三个保守的铜离子结合位点(CUA，CUB和CuC)，分别位于氨基酸序列的183～240，336～378an

3、d53l～567区域，五个茶树品种的PPO基因序列之间的核酸相似性为98．2％．．99．9％，氨基酸序列相似性为94．7％一96．1％。(2)．PPO前导肽功能以及表达载体分析。将PPO全长基因和前导肽基因分别克隆到pET30c载体，不能够在DE3中诱导表达；将去除PPO前导肽的成熟PPO基因片段克隆到PET30c载体和PET32a，能够在DE3中诱导表达。表明前导肽基冈有可能抑制PPO基因的原核表达。PET30c载体表达效率高于pET32a载体。(3)．原核表达蛋白条件以及复性方法分析。把成熟PPO基因克隆到PET30c载体。30min，100umOl／LIPTG，28℃诱导表达的可溶蛋白多

4、，但蛋自主要是不可溶蛋白。用50m01／LTriS-HClPH=7．5，5mm01／LDTT，2％TriS-X一100，5mmOl／LNaC1将不可溶蛋白悬浮，复一阵后所得酶活力为20．12U／mg。用20mOl／LTriS·HCl，pH=7．5，1％TritonX一100，将不可溶蛋白洗后，复性后所得酶活力为15．23u／mg(4)．PPO结构与功能的关系分析。PCR扩增去除前导肽的不同PPO基因片段并连接到PET30C载体，在DE3中进行蛋白诱导。表明去除CUC区的PPO活力最高，其次酶活力从高到低依次为切除PPO前导肽的成熟多肽，切除PPOC末端的多肽，切除酪氨酸酶以外部分的多肽。(5)

5、．酵母表达成熟PPO基因。把成熟PPO基因克隆到非分泌载体PPICZA和分泌载体PPICZaA，在毕赤酵母GSll5表达的酶活力分别29．12U／mg和26．92U／mg。关键词：多酚氧化酶原核表达真核表达蛋白复性IVCLONINGANDMIROBIALEXPRESIONOFTEAPOLYPHENOLOXlDASEABSTRACT：Major：CellbiologyName：Yi一1iangWuSupervisor"Prof．Hai—hangLiPolyphenoloxidase，s(PPOs)playimportantr01esinteaprocesslng·Itaffectsthecolo

6、r，qualityandthetransformationoffunctionalSUbstancessuchastheaflavinandthearubigin．PPOalsousedinmedicineandclothing，However，resourcesofPPOareshortagewhichlimiteditsapplicationinindustries．Inthisresearch，weclonedPPOgenesfromfivecultivarsofteaplants(Camelliasinensis)．Itsstructure—activerelarionshipsand

7、expresslonlnE．coliandyeastswerestudyed．ThemainresultSareasfolJOWs：(1)CloningandstructureanalysisofPPOgenes．PPOgenesoffivetopcultivarsofChinesetea(C．JinensfJcv．LongJing，cV·Qihong，CV．Xiangbolv，cv．Tiegua