小分子抑制剂与mc1-1蛋白作用模式及分子优化的研究

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1、硕士学位论文小分子抑制剂与Mcl-1蛋白作用模式及分子优化的研究StudyofthebindingmodeofsmallmolecularinhibitorwithMcl·1andmolecularoptimization学21118081完成日期：2014．5．5大连理工史学DalianUniversityofTechnology大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作

2、的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：作者签名：大连理工大学硕士学位论文摘要Bcl．2家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，二者通过BH3沟槽发生的相互作用来决定细胞是否凋亡。研究发现多种肿瘤细胞的抗凋亡蛋白例如Mcl．1与Bcl．2蛋白的过量表达，使细胞逃避凋亡，获得永生。因此抗凋亡蛋白是抗癌药物研发的重要靶点。靶向Bcl．2抗凋亡蛋白的小分子抑制剂可以通过与抗凋亡蛋白的BH3沟槽结合，释放出促凋亡蛋白，导致癌细胞的凋亡。Mcbl和Bcl．2是抗凋亡蛋白的两个典型代表，同时结合Bcl．2与Mcl．1蛋白，并拮抗两

3、个蛋白的功能，是靶向Bcl．2家族小分子抑制剂的发展方向。由于Mcl．1的BH3沟槽与Bcl．2蛋白有一些差异，因此现有的Bcl一2小分子抑制剂多数不能同时与Mcl．1蛋白结合，通过研究小分子抑制剂与Mcl．1蛋白的结合模式，可以获得Mcl．1蛋白BH3沟槽的特征性结构信息，指导Mcl．1抑制剂或者Mcl．1／Bcl．2双抑制剂的分子设计，获得亲和力更好的抗癌先导分子。首先我们构建了Mcl．1蛋白的表达质粒。通过优化蛋白表达的诱导条件，15N标记的Mcl．1蛋白的表达量达到7．9me／L，与未标记Mcl．1蛋白的表达量(8．3mg／L)相仿。通过镍柱亲和层析洗脱条件的优化与分子筛层析，将

4、蛋白的纯度提高到了95％以上。圆二色谱结果显示纯化所得Mcl一1蛋白具有正确折叠的二级结构。同时蛋白NMR一维图谱和二维图谱结果显示，15N标记的Mcl一1蛋白的谱峰分散良好，表明其高级结构正确，纯化后的蛋白活性良好，满足后续的二维核磁实验的要求。接着对本课题组设计合成的小分子C1(2，3．dihydroxyanthracene一9，10-dione)进行分子对接实验，获得了Mcl一1蛋白中与C1的结合模式，发现C1与R263形成了氢键，Cl的蒽醌骨架横跨R263到p3口袋。然而，骨架末端的苯环指向Mcl．1蛋白的p3口袋但并未占据p3口袋。继续设计了小分子C2(6-bromo．2，3．

5、dihydroxyanthracene一9，10一dione)，以占据Mcl．1蛋白的p3口袋。荧光偏振实验测得c2对Bcl．2以及Mcl一1蛋白飚值分别为132nM和107nM，和c1亲和力相比分别提高了三倍和四倍。1H一15NHSQC二维核磁结果表明C2结合于Mcl—l蛋白表面的BH3结合沟槽从，其中R263残基的化学位移最大。C2的溴原子与Mcl．1蛋白p3口袋的F228残基相互作用，分子对接实验也直观的证明了C2的溴原子占据了Mcl．1的p3口袋。随后，在C2的基础上设计了C3、C4、C5、C6，用硫原子替换溴原子，并在硫原子上接上较长的取代基，以占据Mcl．1蛋白的p2El袋。

6、荧光偏振实验表明这四个小分子对Mcl．1蛋白和Bcl．2蛋白的亲和力比C2均有明显提升，特别是C6小分子(dihydroxy一6一((4-isopropylphenyl)thio)anthracene一9，10-dione)，其对Bcl．2和Mcl．1的蜀值分别是24nM和13nM。与C1相比，分别提高了约13倍和38倍。HSQC实验表明，除了在c2中发生化学位移的氨基酸，C6滴定Mcl．小分子抑制剂与Mel-1蛋白作用模式及分子优化的研究1蛋白新增的化学位移氨基酸残基包括Mcl一1蛋白p2口袋的M250和F270，证明了C6达到了与Mel．1蛋白的pa口袋相互作用的目的。HSQC辅助分

7、子对接的方法指导设计了高亲和力的Bel-2／Mcl．1双抑制剂c6。关键词：1H．15NHSQC二维核磁；小分子抑制剂；Mcl一1；结合模式；分子对接大连理工大学硕士学位论文StudyofthebindingmodeofsmallmolecularinhibitorwithMcl-1andMolecularoptimizationAbstractBcl--2familyincludinganti-apoptoticaswellasp