家蚕bmhsp20.8蛋白线粒体定位机制及分子伴侣功能的研究

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4、条件下高表达，在正常情况下的组织中也广泛存在。随着家蚕(Bombyxmori)基因组测序的完成，家蚕小分子热休克蛋I刍(smallHSP,sHSP)的研究也有了许多新进展。目前对家蚕sHSP功能的研究甚少。家蚕热休克蛋白基因BmHSP20。8的ORF框大小为561bp，编码186个氨基酸，亚细胞定位预测结果发现BmHSP20．8有51％可能性定位于线粒体，13％可能性定位在细胞的其它位置，29％可能性分泌到胞外。本研究进一步通过实验方法鉴定和研究了BmHSP20．8蛋白的亚细胞定位及其机制，并对其分子伴侣活性和互作蛋白进行研究。为了鉴定BmHSP20

5、．8蛋白的亚细胞定位情况，我们将BmHSP20．8基因克隆到plEx．1昆虫表达载体进行HIS标签融合表达，为了直观的观测该蛋白在细胞中的分布情况，我们进一步构建了带EGFP标签的BmHSP20。8真核表达载体。将构建好的载体转染家蚕BmN细胞，72小时后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的分布情况，并提取细胞的胞质和线粒体蛋白，Westemblot分析该蛋白的定位情况。结果表明BmHSP20．8蛋白只存在于线粒体中，而胞质中没有检测到该蛋白的存在，显示BmHSP20．8蛋白只在线粒体中特异性表达。同时，与EGFP融合表达结果显示，当EGFP位于BmHSP

6、20，8蛋白C端时，融合蛋白只存在于胞质中，而当EGFP位于BmHSP20．8蛋白N端时，融合蛋白在胞质和线粒体蛋白中均能检测到，表明BmHSP20．8蛋白的线粒体定位信号位于该蛋白的COOH端。为了进一步确定BmHSP20．8蛋自的线粒体定位信号区域，我们构建了带有EGFP标签的截短型BmHSP20．8真核表达载体，表达的EGFP和截短BmHSP20．8融合蛋白可用于蛋白的定位信号区域鉴定。将截短型载体转染家蚕细胞，72小时后提取胞质和线粒体蛋白，Westernblot分析蛋白的定位情况。结果表明，BmHSP20。8蛋白的线粒体定位信号区域由该蛋白

7、基因ORF框的427bp．561bp区域编码，位于该蛋白C端的143aa．186aa区域。分子伴侣活性是HSP蛋白的重要功能活性。为了研究BmHSP20．8蛋白的分子伴侣功能，首先我们通过和SUMO的融合成功实现了该蛋白的可溶表达，纯化和ULPI酶切获得BmHSP20．8蛋白，表达蛋白经胰蛋白酶(trypsin)敏感实验，在较短时间内被完全水解，表明此蛋白未形成稳定的寡聚体结构。通过柠檬酸合酶(CS)的热聚集实验证实BmHSP20．8蛋白具有分子伴侣活性。这一结果为研究家蚕小热休克蛋白功能奠定基础。BmHSP20．8蛋白定位于细胞线粒体中，可能和其它

8、线粒体蛋白相互作用从而行使其浙江理工大学硕士学位论文家蚕BmHSP20．8蛋白线粒体定位机制及分子伴侣功能的研究分子伴侣等生物学功能。我们将构建好的pIEX．1．BmHSP20．8载体转染家蚕BmN细胞，采用HISpulldown方法用HIS单抗对BmHSP20．8蛋白进行免疫共沉淀，利用鼠IgG作阴性对照，成功免疫共沉淀出BmHSP20．8蛋白及结合蛋白。将免疫共沉淀后的蛋白样品进行SDS．PAGE检测，银染结果发现HIS单抗免疫共沉淀的样品中，在100．130kDa之间有一条特异性的条带，而在鼠IgG免疫共沉淀对照中却无此条带，表明在100．13

9、0kDa之间存在与BmHSP20．8相互作用的蛋白，为后续互作蛋白的鉴定奠定基础。关键词：BmHSP20．8