家蚕亲环蛋白a表达和亚细胞定位的研究

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1、浙江理工大学硕士学位论文摘要亲环蛋白(Cyclophilin，CyP)是发现于1984年的一族胞浆蛋白，因其能与免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)结合而得名。CsA作为一种免疫抑制剂，在人类器官移植中，是预防移植排斥反应的重要药物。CsA可通过干扰T细胞的信号传导途径以阻断钙调磷酸酶的活性。而CsA只有在与其目的蛋白Cylophilin形成CsA---Cyclophilin复合体后才使T细胞膜蛋白错误折叠从而发挥免疫抑制作用。我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列，序列比对后推

2、测可能是家蚕亲环蛋白A基因，我们将其命名为BmCyPA，GenBank登录号为AB206402。该基因序列ORF长为498bp，编码166个氨基酸，预测蛋白分子量为17．96kDa。我们将扩增到的BmCyPA基因克隆到融合表达载体pET-28a相应的酶切位点上，得到融合蛋白表达质粒pET-28a(+)-BmCyPA，经PCR、酶切鉴定以及测序证明重组子是正确的。将该重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)，用终浓度为0．1mM的IPTG诱导重组菌后，裂解细菌做SDS—PAGE检测分析，与阴性对照相比

3、在22kDa处有一特异性蛋白条带，与预期值(融合标签3．56kDa，BmCyPA17．96kDa)相符。融合蛋白以可溶性形式表达，故用超声裂解菌体后12000rpm离心所得上清以亲和层析的方法纯化目的蛋白His-tagBmCyPA。经FPLC反相柱层析进一步纯化后，再进行质谱分析，得到的该融合蛋白的分子量为21410．0Da，证实了该蛋白表达的J下确性。以纯化所得蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔，制备了该重组蛋白的多克隆抗体，ELISA检测该抗血清的效价可达到1：12800以上。提取家蚕五龄幼虫的各组

4、织蛋白，用于Westernblotting实验。实验结果表明，BmCyPA蛋白在家蚕的马氏管、气门、表皮、脂肪体、中肠、丝腺、头部、卵巢中均有表达。亚细胞定位结果表明，该蛋白主要存在于细胞质中。我们还利用荧光定量PCR的方法，对家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾等发育时期，以及五龄幼虫各组织中的靶mRNA的量进行比较。关键词家蚕；亲环蛋白A；原核表达；组织定位；亚细胞定位；荧光定量PCR浙江理工大学硕士学位论文AbstractCyclophilin，whichisfoundasakytoplasmfami

5、lyproteinin1984．ItwasnamedforbindingwithcyclosporineA(CsA)．CsAisanimportantmedicinetoprotectrejectreactioninexplantationofhumanorgantransplantation．CsAmayblockitsactivenessbydisturbtheTcell'ssignalconduction．CsAdisplayimmunosuppressionfunctiononlywhe

6、nformCsA—CyclophilincomplexwithinterestproteinCyclophilin．Accordingtothelarge—scaleeDNAsequencingofsilkwormpupae，aBombyxmoriCyclophilinAeDNAwasidentifiedafterBlastbasedonNCBIdatabase，ofwhichtheacw七ssionnumberWasAB206402．ThisORFcontained498bp，encoding

7、apolypeptideof165aminoacidswithapredictedmolecularweightof17．96kDa．AfterclonedintopET一28aandexpressedinE．coliBL21(DE3)，theBmCyPAWasfusedwithHis-tagandpurifiedonchelatingcolumns．Themolecularweightofthisfusionproteinwas21410．0Da(Histagwasweightof3．56kD

8、a,andBmCyPAwasweightof17．96kDa)，characterizedbymass·spectrumafarlacingfurtherpurifiedon10RIFPLC．ThisresultprovedthatHis-tagBmCyPAWasexpressedintherightform．ThepurifiedfusionproteinWasusedtoimmunizeamaleNewZealandrabbit．Then,antiserumWasharvested，andl