家蚕一新基因bmpseg原核表达及亚细胞定位

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1、浙江理工大学硕士学位论文摘要在对自建的家蚕蛹期eDNA文库测序中，我们筛选到一条eDNA序列，GenBank登录号DY231426，通过生物信息学分析，该基因同源性很低，而且也没有发现保守结构域。该基因长度为661bp，其中5'UTR长99bp，3'UTR长76bp，ORF长486bp，编码161个氨基酸残基，蛋白分子量为18．61kD，理论等电点为9．461。Unigene分析预测该基因只在蛹期表达，因此，将其命名为pupa-sepeeifieexpresstiongene(Bmpseg)。利用生物信息学分析方法预测该基因的蛋白

2、存在跨膜区和信号肽。通过PCR把Bmpseg的ORF扩增后插入到载体PGEX-4T．3的BamHI和XhoI位点，获得重组表达质粒pGEX-4T-3．Bmpseg，转化大肠杆菌Rosetta，经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。IPTG诱导后裂解菌作SDS．PAGE分析，在44．6kD处有一浓集特异性蛋白条带，与预期值相符。融合蛋白以不溶性的包涵体的形式存在，超声波裂解菌体分离包涵体并离心、洗涤；对包涵体进行溶解和梯度透析复性；采用亲和层析法纯化融合蛋白Bmpseg。以该融合蛋白为抗原免疫新西兰大白兔，制备了Brnpseg

3、多克隆抗体，经ProteinAHP凝胶柱纯化后，ELISA检测该抗体的效价可达到1：12800。免疫印迹检测显示该抗体对Bmpseg有特异性识别能力。提取五龄蚕脂肪体、马氏管、气管、睾丸、肠、头、丝腺、表皮等不同组织总蛋白和不同发育时期总蛋白，做免疫印迹试验，结果表明该蛋白只在蛹期表达，推测该基因可能是蛹期特异性表达基因。亚细胞定位表明蛋白定位在细胞质。关键词家蚕Bmpseg基因包涵体纯化亚细胞定位浙江理工大学硕士学位论文ExpressionandsubcellularlocalizationofanewgeneBmpsegfro

4、msilkworm，BombyxmoriAbstractAccordingtothelarge—scaleeDNAsequencingofsilkwormpupgauniqueunknownBombyxmoileDNAwasidentifiedafterBlastbasedonNCBIdatabase，itsgenebankaccessionnumberisDY231426．Theproteinsequenceofthisgeneshareslowhomologouswithothergenes’inNCBI，furthermor

5、e，thisproteinhasnoconverseddomains．Thefulllengthofthegeneis661bpwhichcontains5q3TR(99bp)，ORF(486bp)and3qdTR(76bp)．TheORFencodes161aminoacids谢mthepredictedmolecularweightof18．6kDandisoelectriepoiIltof9．46．Unigeneanalysispredictthatthisgeneisonlyexpressedinpupastage，SOi

6、tWasnamedaspupa-sepecificexpresstiongene(Bmpseg)。TheproteinsequenceofBmpsegWasanalysedbywebsiteofHydrophobicityanalysis,transmemberanalysisandsignalpeptideanalysis，theresultsindicatethattheBmpsegproteinmayhastransmemberre西onandsi粤1a1peptide．Twoprimersweredesignedtoobt

7、ainthecodingregionofBmpseggenefromsilkwormpupaESTdatabase．TheORFofthegeneWasclonedintopGEX-4T-3vectorwithBamHIandXhoIdigestion．TherecombinantplasmidWastransformedintoE．coliRosetta．PCRanddigestionwithBamHI／XhoIshowedthatthedesignedfragmentWasinsertedcorrectly．Therecomb

8、inantplasmidWassequencedandthesequencemapindicatedthatarecombinantexpressionplasmidwasconstructedsuccessfully．Recombinantpro