百合无症病毒16kDa基因的克隆、原核表达及亚细胞定位

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1、万方数据硕士学位论文百合无症病毒16kDa基因的克隆、原核表达及亚细胞定位Cloning、ProkaryoticExpressionandSubcellularLocalizationof16kDaProteinofLilysymptomlessVirus学号：21218085完成日期：2Q!垒生墨旦大连理工大学DalianUniversityofTechnology万方数据lIIIUlIIIIIIIIIIUlY2820216--——大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所

2、知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：亘佥五瘗疽查!鱼迪垒基因鲍立隆!厦趑盍达丞垩细胞度焦作者签名：薹塑日期；竺!复年—L月j￡日万方数据大连理工大学硕士学位论文摘要百合无症病毒(Lilysymptomlessvirus，LSV)属麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，是侵染百合的主要病毒之一。该病毒能够被蚜虫以非持续

3、性的方式或者被棉蚜以持续的方式传播。LSV是一种纤维状的病毒颗粒，长度约为640nm宽度约为17．18nm，基因组为正单链RNA分子，3’端含有PolyA尾巴，5’端有帽子结构，含有6个开放阅读框(ORE)，编码4个蛋白，依次为：RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，三基因盒蛋白(TGBpl，2，3)，衣壳蛋I兰t(CP)和未知功能的16kDa蛋白。本研究主要围绕病毒3’端未知功能的16kDa蛋白展开的。本文主要研究LSV．16kDa蛋白的基本理化性质和结构特点对揭示LSV的致病机理有重要的作用。本文采用RT．PCR法克隆出LSV．16kDa基因

4、，得到了一个基因全长为423bp的cDNA序列，该序列编码140个氨基酸。为了研究LSV．16kDa蛋白的系统进化关系，我们将已测序获得的序列与从GeneBank上获取的5种不同地区病毒的DNA和氨基酸序列比对后发现，相似性分别高达97％～99％和89—99％，而且16kDa-DaLian与16kDa．India的相似性较高，表明这两个物种可能来自同一进化来源。此外，我们还研究LSV同属不同物种间的进化关系，我们选取GeneBank序列数据库中属于Carlaviruses属的12种与16kDa蛋白相似的氨基酸序列，系统进化分析表明16kDa．DL

5、与Llv(Lilylatentvirus)最接近。针对未知功能的LSV一16kDa蛋白的物理化学性质进行生物信息学分析表明：该蛋白的等电点为9．89，蛋白分子量为16194．8，有11个负电荷残基，24个正电荷残基，原子数为2288。LSV．16kDa为亲水性较强的蛋白；其二级结构有2a螺旋和3个延伸链，不存在信号肽结构，为非分泌型蛋白；其氨基酸序列中含有一个典型的调节病毒转录的CarlaC4超蛋白家族，该CarlaC4保守区域位于16kDa蛋白的第28～117位氨基酸，全长为91，BitScore：109．39，E．value：2．02e．31

6、．疏水性分析表明它是一个亲水性蛋白。卷曲结构主要出现在N端C端和两个螺旋之间。我们利用I-TASSER预测LSV．16kDa蛋白的三维结构。通过IPTG进行诱导表达并利用SDS．PAGE进行检测，目的菌液中有明显的特异性条带，大小为45kDa(含有29kDa的GST标签)，说明16kDa蛋白得到大量的表达。最佳的原核表达条件是当温度为30℃、IPTG浓度为O．1—0．5mmol／L、诱导6h时，这时GST．16kDa融合蛋白以可溶性形式表达量较多，以包涵体形式表达量较少；经Bradford法测定其蛋白浓度为O．65mg／mL。以上的结果为LSV一

7、16kDa蛋白抗体的制备、蛋白功能分析以及LSV致病机理的研究奠定了基础。万方数据百合无症病毒16kDa基因的克隆、原核表达和亚细胞定位我们利用生物信息学软件分析LSV．16kDa蛋白的亚细胞定位分布情况，并利用瞬时侵染的方法和荧光定位法观察16kDa与GFP融合蛋白在洋葱内表皮细胞中的定位情况，实验表明，融合蛋白16kDa-GFP和GFP．16kDa位于细胞核中并且均匀的分布于整个细胞核中。关键词：百合无症病毒(LSV)；基因克隆；16kDa蛋白；序列分析；原核表达；亚细胞定位万方数据大连理工大学硕士学位论文Cloning，Prokaryoti

8、cExpressionandSubcellularLocalizationof16kDaProteinofLilysymptomless