百合无症病毒tgb基因克隆、表达及定位分析

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1、犬達嫂－大－爱ＤＡＬＩＡＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹｆｉ面士孝位论文ＭＡＳＴＥＲＡＬＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ百合无症病毒ＴＧＢ基因克隆、表达及定位分析生物化工学科专业作者姓名避籰指导教师徐品二副教授２０１５年６月９日答辩日期＿＿＿硕士学位论文百合无症病毒ＴＧＢ基因克隆、表达及定位分析ＣｌｏｎｉｎＥｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｆｏｒＴＧＢｏｆＬｉｌｇ，ｐｙＳｙｍｐｔｏｍｌｅｓｓＶｉｒｕｓ

2、作者姓名：吴海霞学科、专业：生物化工学号：２１２１８１１２指导教师：徐品二副教授２０５６月完成日期：１年大ｉ理工大營ＤａｌｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果一同工作的同志对本研究所做的贡献。与我

3、均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。ＴＧＢ某因克降、表达及定位分析学位论文题目：百合无症病毒ｉ：作者签名：ｌｌｔ期年（月（Ｔ曰日大连理工大学硕士学位论文摘要自发现植物病毒的运动蛋白以来，对不同种类运动蛋白的结构、功能的研究已经比较深入，但是对于百合无症病毒Ｌｉｓｍｐｔｏｍｌｅｓｓｖｉｎａ！ｌＳ＼０运动蛋白的研究还处于初ｌｙｙ，级阶段。本研究通过引物扩增获得ＬＳＶ的运动蛋白基因；对基因序列进行比对，构建ＴＧＢｌ进化树，，利用

4、生物信息学软件对基因进行分析；构建原核表达载体诱导表达ｐ；利用绿色突光蛋白融合技术，对运动蛋白进行定位分析。研究结果对了解ＬＳＶ运动蛋白的结构和功能，以及在病毒侵染过程中的作用机制具有重要的理论参考价值。“”设计引物西伯利亚，扩增获得ＬＳＶ的运动蛋，以感病百合叶片总ＲＮＡ为模板白基因，运动蛋白基因全长１１６１ｂｐ，含有三个重叠基因（ＴＧＢ１、ＴＧＢ２、ＴＧＢ３），称为三基因连锁结构（Ｔｒｉｐｌｅｅｎｅｂｌｏｃｋｓ，ＴＧＢ）。生物信息学分析显示，基因编码三段运动ｇＴＧＢｌ２８ａａＴＧＢ１ＴＧ

5、Ｂ３ＬＳＶ－ＴＧＢｌ与蛋白ｐ（２）、ｐ２（０６ａａ）、ｐ（６４ａａ）；进化树分析显示－ＴＧＢ２与百合百合潜隐病毒和伽蓝菜属潜隐病毒的ＴＧＢ１相似度较高，ＬＳＶ潜隐病毒相－似度较高，ＬＳＶＴＧＢ３与紫茉莉斑点病毒相似度较高，ＴＧＢ１的保守性最高，ＴＧＢ３的保守性最差；ＴＧＢｐ３为疏水性蛋白；ＴＧＢｐｌ为多功能蛋白，具有ＲＮＡ解旋酶和核酸水解酶活性，，氨基酸序列中含有ＡＴＰ结合区和核酸结合区在病毒运动中起主导作用；ＴＧＢｐ２保守性较高，与马铃薯病毒Ｘ（ＰＶＸ）类病毒的ＴＧＢｐ２相似度高，并且

6、ＴＧＢｐ２、ＴＧＢ）３都为结构性蛋白，结合到内质网上，在病毒运动中起到辅助作用ＴＧＢｌ无跨；ｉｐ膜结构域２ＴＧＢ３一，ＴＧＢ、分别有两段；三段蛋白都ｐｐ、段跨膜结构域没有卷曲螺旋结构；构建三段蛋白的三维结构模型。－＋入大肠杆菌ＢＬ２将ＴＧＢ１基因连接表达载体ＰＥＴ２８ａ），转１（ＤＥ３）感受态细胞（－－ｓ中，诱导ＴＧＢｐ〗的表达，ＳＤＳＰＡＧＥ以及ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ验证带有Ｈｉ标签的ＴＧＢｐｌ成功表达，对表达产物进行质谱分析，获得质谱结果。利用亲和层析的原理，根据包涵体纯化的方法，成功

7、纯化得到纯度较好的ＴＧＢｐｌ。利用绿色焚光蛋白融合技术，将三段ＴＧＢ基因连接ｅＧＦＰ，插入到双元表达载体－１１Ｖ１１ＰＴＦ１０．３５Ｓ上，转入农杆菌Ｇ３０感受态细胞中，侵染洋葱表皮细胞，用共聚焦显－微镜观察三段蛋白在洋葱细胞上定位情况，发现，ＴＧＢｐｌＧＦＰ主要定位在细胞壁或呈点状嵌入细胞壁质内部ＴＧＢ２与ＴＧＢ３主要位。，少量位于胞；ｐｐ于细胞内关键词：百合无症病毒（ＬＳＶ）；运动蛋白；三基因连销结构（Ｔｒｉｐｌｅｇｅｎｅｂｌｏｃｋｓ，ＴＧＢ）；蛋白表达；亚细胞定位Ｉ百合无症病毒

8、ＴＧＢ基因克隆、表达及定位分析ＣｌｏｎｉｎＥｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＬｏｃａｔｉｏｎｆｏｒＴＧＢｅｎｅｏｆＬｉｌｓｍｔｏｍｌｅｓｓｖｉｍｓｇ，ｐｇｙｙｐＡｂｓｔｒａｃｔＳｉｎｃｅｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓｆｏｕｎｄｔｈｅｍｏｖｅｍｅｎｔｒｏｔｅｉｎＭＰｏｆｌａｎｔｖｉｒｕｓｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄ