蛋白亚细胞定位方法.doc

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1、1.挑单克隆斑加到30mlLB中，加AMP。37℃摇过夜。2.分别取15ml菌液加到1L的LB中，加AMP，继续在37℃下摇至OD600=0.5-0.6,严格控制OD。3.加IPTG，使终浓度达到0.2mM,18℃摇过夜。4.在4℃下以7700×g(e.g.8000rpm)离心10min.5.弃去上清，放在冰上。6.加入30~50mlice-cold1×PBS，用移液器悬浮细胞。7.用超声波超生。取一部分超生后的产物用SDS-PAGE检测。8.向溶液中加入20%的Trionx-100，使终浓度达到1%。Mixgentlyfor30mintoaidinsolubilizat

2、ionofthefusionprotein。应该是在冰上。9.10000rpm离心for10minat4°C.转移上清到一个新的容器中。1×PBS(ice-cold):Dilute10×PBSwithsterileH2O.Storeat4°C.10×PBSis1.4MNaCl,27mMKCl,100mMNa2HPO4,18mMKH2PO4,pH7.3.1×PBSis140mMNaCl;2.7mMKCl;10mMNa2HPO4;1.8mMKH2PO4,pH7.31L,1×PBS配方如下：称取NaCl8.18g;KCl0.2g;Na2HPO4.12H2O3.58g;KH2PO

3、40.245g溶于800ml水中，用HCl调节PH=7.3，最后加蒸馏水定容至1L,高温高压灭菌。