胡枝子高质量rna的提取及almt基因片段的克隆和表达分析

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1、土壤(Soils),2011,43(3):433~438胡枝子高质量RNA的提取及①ALMT基因片段的克隆和表达分析陈志长1,2，赵学强1，沈仁芳1*（1土壤与农业可持续发展国家重点实验室（中国科学院南京土壤研究所），南京210008；2中国科学院研究生院，北京100049）摘要：针对木本植物胡枝子组织中多糖、多酚等次生物质含量高的特点，采用改良的CTAB法，成功地从胡枝子组织中提取了总RNA。所提取的胡枝子总RNAOD260／OD280值介于1.9~2.1之间，产率介于100~250μg/g之间。采用该方法提取的胡枝子总RNA，经过RT-PCR成功地克隆到了胡枝子A

2、LMT基因片段，克隆得到的胡枝子ALMT基因片段序列与已知ALMT基因序列之间具有较高同源性，经半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR表达分析，证明该基因在根中表达且受铝诱导。试验结果表明利用改良的CTAB法提取的胡枝子总RNA样品质量较高，能够用于基因的半定量和定量表达分析。关键词：胡枝子；改良CTAB法；RT-PCR；ALMT基因；铝中图分类号：S541+.5[13]胡枝子是一种多年生豆科灌木，耐寒，耐旱，广枝子最主要的耐铝机制之一，而胡枝子有机酸分泌[1]泛适应于酸性土壤。胡枝子不仅能够在短时间内增的分子机制却一直未见报道。本试验尝试采用改良后加土壤有机质含量，

3、还能够通过共生固氮的作用增加的CTAB法提取的RNA，用其逆转录后的cDNA来扩土壤含氮量，从而大大增强土壤肥力，因此常用作土增胡枝子ALMT，并对其进行初步的半定量和定量表[2]壤改良。达分析，由此来检验提取的总RNA的质量，并为进一由于胡枝子属于木本植物，具有比动物、微生物步扩增胡枝子ALMT基因全长和研究其功能，探讨胡以及草本植物更为厚实的细胞壁，并且组织中多酚、枝子耐铝的分子机制打下基础。[3]多糖等次生代谢物的含量较高，利用传统的CTAB1材料和方法方法来提取胡枝子RNA的效果不太理想。RNA质量[4]1.1试验材料和培养方法的好坏直接影响后期分子试验的进展

4、，因此一个好的提取RNA的方法对于胡枝子来说就至关重要。本试供试材料为中国江西二色胡枝子株系（Lespedeza[5][6]bicolorTurczcv.Jiangxi），取自中国科学院鹰潭生态实验参考胡根海等和沈乾等的方法，提出一种高质量[7][13]提取胡枝子总RNA的方法，比起传统的CTAB方法验站，是一种耐铝胡枝子品种。种子经浓硫酸处理和昂贵的RNA试剂盒方法，本方法具有效果好，成本10min左右，冲洗数次，以去除表面附着的硫酸，放低，安全性高的优点。入蒸馏水中浸泡过夜，选取吸水胀大的种子放入衬有植物ALMT（aluminum-activatedmalatet

5、ransporter）滤纸的培养皿中催芽2~3天。幼芽至2~3cm时，移基因是编码位于细胞膜上的苹果酸转运蛋白的基因，至盛有2.5LCaCl2（0.5mmol/L，pH4.5）溶液培养5~该苹果酸转运蛋白具有在铝诱导下将苹果酸从膜内转7天后，选取较为一致的幼苗在含有AlCl（350μmol/L）[8]的CaCl（0.5mmol/L，pH4.5）溶液中处理3h，分别运到膜外的功能，通过苹果酸与铝在细胞膜外的络2合作用，形成无毒的络合物，从而使土壤中的铝对植提取根部和地上部总RNA，并作无铝对照处理。育苗[9]整个过程在光照培养室中进行。植物生长室条件：温物的毒害大大降低

6、。目前国内外学者已经从小麦、拟南芥、油菜和大豆等植物中克隆到了ALMT基因度为25℃±2℃，相对湿度为70%，光强为375μmol[8,10,11-12]photon/(m2·s)，昼夜循环为光14h/黑暗10h。。胡枝子通过根部分泌有机酸来解铝毒，是胡①基金项目：国家自然科学基金项目（40871144，30821140538）和中国科学院南京土壤研究所知识创新工程领域前沿项目（ISSASIP0706）资助。通讯作者（rfshen@issas.ac.cn）作者简介：陈志长（1985—），男，浙江温州人，硕士研究生，主要从事分子植物营养研究。E-mail:zcche

7、n@issas.ac.cn434土壤第43卷1.2试剂配制s、72℃60s，35个循环；72℃保温10min。反应结束后提取液：2%CTAB（w/v），4%PVP（w/v），100点样5μl于2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。mmol/LTris-HCl（pH8.0），25mmol/LEDTA（pH8.0），1.4.4实时荧光定量PCR取RNA1μg，用TM2mol/LNaC1，0.05%亚精胺，2%β-巯基乙醇（用时PrimeScriptRTreagent试剂盒（TAKARA）合成第一加入）。SSTE缓冲液：1mol/LNaCl，0.5%SDS，1