人脂肪干细胞基本生物学特性、表面抗原及成骨、成脂分化潜能研究

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1、安徽医科走学硕士学住论文人脂肪干细胞基本生物学特性、表面抗原及成骨、成脂分化潜能的研究1．前言创伤、肿瘤术后或先天性缺陷等导致的组织器官缺损，是临床上常见的、亟待解决的难题，是整形外科医师面临的主要挑战。目前主要的治疗手段——自体组织移植术，存在着移植物坏死、被吸收、组织量不足及供区继发畸形等缺陷；异体或异种组织移植，面临着免疫排斥及潜在的疾病传播等问题；而近几十年来一度风靡的人工合成材料，由于存在组织排异、有悖正常生理功能、影响疾病诊断及可能潜在的毒性甚至致癌作用等问题，临床应用大大受到限制【11。近年来迅猛发展的组织工程技术可能为组织

2、器官的修复与替代带来光明的前景。组织工程技术是将细胞生物学和材料学相结合，在体外或体内构建组织或器官的一种新兴技术，包括三大要素——种子细胞、生物材料及体内微环境，其中种子细胞在这三大要素中起着最为关键的作用。在组织工程学发展的过程中，种子细胞的选择经历了不同阶段。早期多应用成熟的组织细胞作为种子细胞，构建组织工程化组织，这些特定的组织细胞在体外培养过程中，分化良好并具有特定表型基因表达。1991年，Vacanfi等12]从小牛肩胛关节软骨中分离出软骨细胞，与可降解的生物材料复合植入裸鼠皮下组织，成功的构建出组织工程化软骨组织。相同原则被

3、成功的用于构建其它组织工程化组织，如骨、肌腱等，这些为组织工程理论的可行性奠定了基础【3l。但由于成熟的组织细胞在体外大量扩增中非常容易老化，导致细胞特异表型的丧失，难以获得足够的数量满足组织工程需要的细胞量，且对供区的损失也较重，有悖于组织工程学的初衷。于是，人们开始寻找具有强大的体外增殖力能力和多系分化潜能的干细胞作为种子细胞。根据干细胞的发生来源，可以将其分为胚胎干细胞和成体干细胞。安徽医科大学硕士学位论文理论上，胚胎干细胞是最佳的选择，但却受到伦理道德、种族观念约束和潜在异体排斥等的限制，前景并不乐观。成体干细胞(adultste

4、mcells，ASCs)是指那些存在于已分化组织中的未分化细胞，在自然条件下，大多处于休眠状态或倾向于分化为所在组织的细胞，以利于维持机体的正常新陈代谢。成体干细胞具有分布广、增殖力强、具有多种分化潜能及不存在伦理学限制等优点，为种子细胞来源提供了新的思路和前景。其中以骨髓基质干细胞(Bonemarrowsteincells，BMSCs)研究最多、应用最广，但是其取材时往往给患者造成很大痛苦，且来源有限，获取效率也非常低(大约每105个黏附问质细胞中能够获得1个BMSC)，应用受到一定限,NL4，51。近年来，随着研究的不断深入，脂肪干细

5、胞(Adipose-derivedstemcells，ADSCsl逐渐被人们发现并迅速进入种子细胞研究领域。ADSCs可以从患者脂肪抽吸物中分离出来，通常每毫升脂肪抽吸物大约可以分离出2x105个ADSCs，其取材简单、来源丰富、增殖能力强，初步显示了作为组织工程种子细胞的巨大优势【4，6，71。目前，虽然对ADSCs取得了一定的研究成果，但仍面临着许多问题有待于进一步阐明。例如，脂肪组织中是否真正存在一类干细胞，其是否是一类纯系细胞，还是由多种前体细胞组成，其细胞活性、增殖分化能力如何，是否存在特异性细胞表面标志等等，仍有待探讨。本课题

6、通过对人脂肪干细胞(humanadipose．derivedstromalcells，hADSCs)的分离、培养和体外诱导，了解其基本生物学特性、定向分化潜fiB(成骨细胞、成脂肪细胞)和表面抗原表达情况，从而可以其进一步识别和高度纯化，为寻找理想的组织工程种子细胞来源提供实验依据。2．材料与方法2．1实验材料2．1．1主要仪器设备BCL．MCL型流式细胞仪C02细胞培养箱美国BECKMAN．COULTER公司上海医用仪器厂安徽医科大学硕士学位论文DYY．8B型稳压稳流电泳仪HettiehUniversal32台式离心机PCR基因扩增仪T

7、GL．16H台式高速离心机UV．3000系列紫外分析仪凝胶数码成像系统电热恒温培养箱超低温冰箱快速恒温数显水浴箱恒温振荡器电泳仪小型水平和垂直电泳槽超净工作台倒置相差显微镜上皿电子天平北京六一仪器厂德国Hettich公司珠海Hema公司上海医用仪器厂SANYO公司常州国华电器有限公司Bio．Rad公司Bio-Rad公司苏州净化设备厂日本OLYMPUS和Nikon公司上海天平仪器厂2．1．2其它器材电子天平、高温灭菌锅、烤箱、微孔滤膜滤器(直径0．221am)、塑料培养皿、染色缸、60瓦灯、吸管、50ml离心管若干，动物手术台、手术器材由安

8、徽医科大学第一附属医院试验动物中心提供。2．1．3主要生化试剂和试剂盒硝酸纤维素膜Amersham公司空白对照试剂IGFl．FITC、IOFl．PEBECKMAN—COULTER公司鼠抗人CD