大豆酯酶的固定化及应用研究

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1、吉林农业大学硕士学位论文大豆酯酶的固定化及应用研究姓名：邵佳甲申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：陈光20080601大豆酯酶的固定化及应用研究摘要由于农药残留而引起的人畜急、慢性中毒的事件屡见不鲜，食品安全问题引起了高度重视，传统的农药残留检测方法是气相色谱法和高效液相色谱法，但是此种方法仪器昂贵，操作复杂，不适合快速检测。近年来利用乙酰胆碱酯酶开展了很多农药快速检测的研究，但乙酰胆碱酯酶的提取产量低，成本高，不能满足当前农药残留检测的需求，而植物酯酶的成本大大低于乙酰胆碱酯酶，保质期也比较长，因此本文以大豆为材料，研究植物酯酶对农

2、药的灵敏性，并且研制了快速检测酶片，主要结果如下：1．大豆酯酶的最佳提取方案为：将大豆样品按1：5料液比加入到0．3mol／L，pH7．0的磷酸缓冲液中，磁力搅拌120min后，于5000rpm下离心，上清液即为大豆酯酶粗酶液。2．研究了大豆酯酶的最适反应条件：大豆酯酶酶液O．1mL，底物a一乙酸萘酯0．1mL，pH值为7．5的缓冲液1．9mL，浓度为0．25mg／mL的显色剂0．9mL，反应总体积稀释至10mL反应时间为5min，反应温度为30℃。3．对26种不同品种大豆进行筛选，确定总酯酶活性最高的通农10作为农药快速检测的品种，考察了大

3、豆酯酶对8种农药的灵敏度，灵敏度为敌敌畏>敌百虫>对硫磷>甲胺磷>乐果>氧乐果>毒死蜱>西维因。4．在三种滤纸(定性滤纸、定量滤纸、厚型层析滤纸)材料中筛选出厚型层析滤纸作为固定化酶材料，确定了固定化参数：酶液浓度为80％，pH值为7．5，固定化温度为4*0，固定化时间24h，鼓风干燥的最佳时间2h，鼓风干燥的最佳温度为40℃。5．硝酸纤维素膜固定化的最佳参数：硝酸纤维素膜预活化条件为：4℃下在0．1mol／LpH7．0的磷酸盐缓冲溶液中浸泡48h。固定化酶液浓度为70％，pH值为7．5，固定化温度为4。C，固定化时间48h，戊二醛浓度为0．

4、25％，不添加牛血清白蛋白。6．壳聚糖膜固定化的最佳参数：酶液浓度为80％，pH值为7．5，固定化温度为4。C，固定化时间24h，戊二醛浓度为0．5％。7．研究了三种固定化酶的部分酶学性质，并与游离酶特性进比较，结果表明固定于壳聚糖膜后，最适温度为30。0，最适pH值为7．0，有良好的重复使用性能；固定于厚型层析滤纸后，最适最适温度为30℃，最适pH值为7．5，保存期限比游离酶大大提高，4。C保存一个月相对活力为90．4％；固定于硝酸纤维素膜后，最适温度为40。C，最适pH值为8．0。8．通过酶活回收率和酶片实用性比较，确定厚型层析滤纸为大豆

5、酯酶固定化的最佳载体，并用此酶片对8种农药进行检测，检测限分别为敌敌畏0．01mg／L，敌百虫为0．1mg／L，对硫磷为O．5mg／L，甲胺磷为O．5mg／L，乐果为1mg／L，氧乐果为10mg／L，毒死蜱10mg／L，西维因50mg／L。关键词：大豆酯酶，固定化，农药检测IIStudiesontheMethodsofPhytoesteraseImmobilizationandItsApplicationAbstractForthepastfewyears，thetoxicosisincidentsofhumanandanimalresult

6、edfromtakingfoodwhichcontainshighlevelofpesticideresiduesarehappenedusually，SOpeoplehasthinkhighlytothesecurityoffoods．Atpresent，GCandHPLCisthecommonmethodfordetectingpesticideresidues，buttheyaretooexpensiveandcomplextouseasamethodforfieldworkdetection．Becausetheorganophosp

7、horusandcarbamatepesticidescaninhibittheactivityofAChE，SOpeopleusethisprincipletodevelopsomeresearchesofpesticiderapiddetection．ButtheexpensiveandthelowextractionofAchEmakeitCannotsatisfytherequirementofpesticiderapiddetection．Phytoesterasehasthelowcostandeasilytostore，SOpe

8、opleusephytoesterasetoreplacetheAChE．thisarticlesusesoybeanasmaterialtostudythesen