乙酰胆碱酯酶的分离纯化及固定化技术研究

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1、摘要乙酰胆碱酯酶(ACHE)是一种重要的生物功能物质。它能够选择性地催化底物乙酰胆碱水解，且其催化活性能被有机磷或氨基甲酸酯类农药所抑制。利用这一特性，针对有机磷和氨基甲酸酯类农药残留测定的胆碱酶抑制快速检测技术近年来越来越受到重视。但是，乙酰胆碱酯酶的来源问题一直是困扰农药残留快速检测技术发展的一个重要因素。如果采用进口酶源不但价格较昂贵，而且到货周期较长，难以满足检测过程的需求。此外，由于游离酶性质不稳定，极易失活，不能重复使用，只有固定化酶才具有使用价值。本文主要对AChE的分离纯化及固定化技术进行了研究。首先，本文以胎牛血清为乙酰胆

2、碱酶源，对其进行了分离纯化技术研究。通过采用硫酸铵逐级沉淀、葡聚糖凝胶柱层析、DEAE纤维素柱层析三步分离纯化过程，可得到单点纯的乙酰胆碱酯酶，表现在凝胶电泳上即由硫酸铵沉淀液的4条谱带减少至一条谱带。其次，本文对乙酰胆碱酯酶的固定化技术进行了研究。采用交联法对酶进行固定是一种广泛采用的固定化方法，本文对影响固化乙酰胆碱酯酶活性的固定化条件，诸如pH值、BSA、GA、明胶的最佳使用浓度进行了实验研究。经交联法固定的乙酰胆碱酯酶，在室温下放置6个月以后酶活性仍可保持6096以上。但是采用交联法对酶进行固定化过程中必须使用双功能试剂戊二醛，此试

3、剂本身会对乙酰胆碱酯酶的活性造成较大伤害，所以经固定化以后酶的活力回收率较低。目前，一种光交联试剂聚乙烯醇苯乙烯吡啶(PvA—SbO)在酶的固定化过程中倍受青睐，本文在实验室合成出PvA—SbQ。经PvA—SbQ固定后的乙酰胆碱酯酶具有较高的活性回收率，而且在室温下放置6个月后，固化乙酰胆碱酯酶的活性仍可保持初始固化酶活性的70％以上。第三，本文在纯化出乙酰胆碱酯酶的基础上，对乙酰胆碱酯酶的部分酶学性质进行了研究，分别考察了AchE最适pH值、温度、底物浓度、酶浓度、反应时间，动力学性质，稳定性及化学物质对其活性的影响，为研制测定有机磷和氨

4、基甲酸酯农药残留的生物传感器打下了基础。关键词：乙酰胆碱酯酶纯化固定化酶abstractAbstractTheacetylcholineesterase(ACHE)isakindofimportantbio-functionsubstance．Itcanselectivelycatalyzethesubstrateofacetylcholinetohydrolyze，butitscatalysisactivitycanberestrainedbyorganicphosphomsortheoxaminicacidesterpesticides

5、．Accordingtothecharacteristic，afastdetectiontechnologyofpesticideresiduewasregardedtobeimportantgradually．ButthesourceofAchEwasoneofimportantfactorswhichaffectedthedevelopmentofpesticideresiduefastdetectiontechnology．Theimportedenzymeisexpensive,andthecourseofimportingneed

6、smuchtime．Inaddition，dissociativeenzymeisunstable，easytolustactivityanditcan’tbeusedagain．However,mobilizedenzymeisofhighusefulvalue．Inthisarticle，thepurificationandmobilizationtechnologyofAchEwasstudied．Firstly,theacetyl—cholinesteraseenzyme(AchE)purificationtechnologywas

7、studied．TheAchEenzymesourceoffetalbovineserumwasseparatedandpurifiedbyammoniumsulfatefractionalprecipitation，sephadexG-100gelcolumnfiltrationandDEAE-cellulosechromatography．TheSDS-PAGEanalysisofthepurifiedenzymepreparationshowedonebandbyproteinstaining．Secondly,theacetyl-c

8、holinesteraseenzyme(Ache)immobilizationtechnologywagstudied．Cross-linkingwasabroadlyusede