酶纯化和固定化

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1、分离纯化的意义:①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。④基因工程的需要酶活力：指酶催化反应的能力1min催化1μmol分子底物转化的酶量为该酶的一个活力单位(Unit)，采用最适条件酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。酶的总活力：指样品的

2、全部酶活力总活力=酶活力×总体积(ml)或　　=酶活力×总质量(g)总活力=活力单位数／ml酶液×总体积(m1)比活力：指酶纯度指标指单位蛋白质所含有的酶活力(Unit/mg蛋白)比活力=活力单位数／mg蛋白(氮)=总活力单位数／总蛋白(氮)mg　回收率(百分产量）：提纯后与提纯前酶的总活力之比回收率=每次总活力/第一次总活力×100%;提纯倍数：提纯后与提纯前比活力之比提纯倍数=每次比活力/第一次比活力基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性;防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；要求在低温下操作;加入的化学试剂不使酶变性;操作中加入缓冲溶液

3、.抽提有效成分的影响因子:1.  pH值2.  溶剂的极性和强度3.  水解酶4.  温度5.  搅拌6.  氧化DTTPVP7.   金属离子1-3mmol/LEDTA8.  抽提液与抽提物的比例5：1一、预处理细胞破碎:机械法：匀浆、研磨、压榨、超声等;非机械法：渗透、酶溶、冻融、化学等细胞破碎方法　　　　组织种类　匀浆大多数动、植物组织　超声　　　　　　　　细胞混悬液　研磨细菌、植物细胞　酶溶细菌、酵母　冻融裂解培养细胞机械破碎通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。捣碎法研磨法匀浆法物理破碎通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的

4、外层结构破坏，而使细胞破碎。温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎有机溶剂:甲苯丙酮丁醇氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎自溶法外加酶制剂法二、抽提（蛋白质溶解）抽提－通常是指用适当的溶剂和方法，使原料中有效成分分离出来的过程。理想的抽提溶液应具备下述条件：1.对有效成分的溶解度大2.对杂质不溶解或溶解度很小3.来源广泛、价格低廉、操作安全酶的提取工作应在获得材料后立即开始，否则应在低温下保存，-2

5、0℃--70℃为宜。或将生物组织做成丙酮粉保存。水溶法:大部分酶或蛋白质能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中,考虑因素：盐浓度、pH(等电点pI)、温度、辅助因子有机溶剂法:酶与脂质结合得比较牢固，不溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中采用不同比例的有机溶剂进行提取,如：乙醇、正丁醇等大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）或0.1mol/LTris-HCl（pH7.5-8.0）缓冲液作提取液。对于一些和脂质结合比较牢固或分

6、子中非极性较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。酶溶液的浓缩:沉淀法吸附法超过滤法透析法减压浓缩法冷冻干燥法超滤膜是具有特定的均匀孔径和孔隙的多孔薄膜。原理：在加压条件下，把酶溶液通过一层只允许水分子和小分子物质选择性透过的微孔超滤膜，而酶等大分子则被截留，从而达到浓缩酶液的目的。冷冻干燥法:冷冻的抽提液在真空状态下，可以由固体直接变为气体。用此原理进行浓缩，有效成分几乎不会破坏。酶的纯化目的:把粗抽提酶液采用科学方法制备成纯度高的酶制品酶的纯化方法:1,溶解度的差异:

7、盐析法,PEG沉淀法,有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法2,热稳定性的差异:热处理沉淀法3电荷性质的差异:离子交换层析法,电泳法4分子大小和形状的差异:凝胶过滤法,超滤法,透析法,离心法5亲和力的差异:亲和层析法6疏水作用的差异:疏水层析法7分配系数的差异:双水相系统萃取法盐溶：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度随盐浓度的升高而上升。盐析：当盐浓度增高到一定数值时，蛋白质溶解度又逐渐下降，直到蛋白质析出。盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用

8、，破坏蛋白质分子表面的水化层。盐析是可逆的。应用：可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质。盐析一般操作步骤：1.选择一定浓度范围的盐溶液使部分杂质呈“盐析”状态，有效成分呈“盐