固定化酶和固定化细胞.ppt

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1、固定化酶和固定化细胞固定化酶的定义所谓固定化酶(immobilizedenzyme)，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。1916年，Nelson和Griffin发现酶的固定化现象；1969年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于生产L-氨基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例；1971年召开的第一届国际酶工程会议上，建议采用统一的英文名称ImmobilizedEnzyme；1973年，固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶连续生产L-天冬氨酸。1986年，利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功。酶固定化技术发展史从目前的发展

2、状况来看，尽管酶种类繁多，但已经固定化的酶却相对有限，采用固定化酶技术大规模生产的企业尚属少数，真正在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个酶种，故仍需大力研究开发使更多的固定化酶和细胞能适用于工业规模生产。发展现状固定化酶的优点同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；稳定性显著提高；可长期使用，并可预测衰变的速度；提供了研究酶动力学的良好模型。固定化酶的制备原则（1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。（2）酶与载体必须有一定的结

3、合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。（4）固定化酶应有最小的空间位阻。（5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。（6）固定化酶的成本适中。固定化酶（细胞）的制备方法酶和细胞固定化方法载体结合法交联法包埋法网格型微囊型物理吸附法离子结合法共价结合法热处理（细胞）1、吸附法通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法

4、。吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。物理吸附法(physicaladsorption)是通过非特异性物理吸附作用将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。包括范德华力、疏水相互作用、氢键。物理吸附法常用的载体：有机载体：纤维素、胶原、淀粉及面筋等；无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。物理吸附法离子吸附法(ionadsorption)是通过离子键使酶与含有离子交换基团的水不溶性载体相结合的固定化方法。此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、β-淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。离子吸附法离子吸附法常用的载体：阴离子交换剂

5、：DEAE-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素等；阳离子交换剂有羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐、Dowex-50等。其吸附容量一般大于物理吸附剂。离子吸附法具有操作简便、条件温和、酶活力不易丧失等优点。此外，吸附过程同时可以纯化酶。2、包埋法包埋法（entrapment）是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。（1）凝胶包埋法将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。凝胶包埋法常用的

6、载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。（2）微胶囊包埋法微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。3、共价键结合法共价键结合法(covalentbinding）是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。（1）酶蛋白N末端的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基。（2）酶蛋白C末端的α-羧基、天门冬氨酸残基的β-羧基以及谷氨酸残基的

7、γ-羧基。（3）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。（4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲哚基。酶蛋白上可供载体结合的功能基团酶共价偶联的载体的功能基团：芳香氨基、羟基、羧基和羧甲基等。载体活化的主要反应重氮法叠氮法溴化氰法芳香烃化法（1）重氮法重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一种。常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。（2）叠氮法即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。含有羟基