海洋芽孢杆菌mp-2酯酶的分离纯化 固定化及应用研究

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1、青岛科技大学硕士学位论文海洋芽孢杆菌MP-2酯酶的分离纯化、固定化及应用研究姓名：秦胜利申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：于建生20110415青岛科技人学研究生学位论文海洋芽孢杆菌MP．2酯酶的分离纯化、固定化及应用研究摘要本实验室白海洋微生物中筛选出一株产羧酸酯酶的芽孢杆荫(BacillusMP．2)，并对其产酯酶条件进行了优化。在此基础上，本实验以海洋芽孢杆菌酯酶为研究对象，对其进行了分离纯化及酶学性质方i)}Ii的研究；以壳聚糖为材料制备了冻干．PVA．壳聚糖固定化酶，并对其在农药降解和手性拆分等领域的应用做了系统的探索。海洋芽孢杆菌酯酶发酵液通过离心(10000r／

2、min、4"C、30rain)、50KDa滤膜超滤后得到粗酶液；粗酶液经硫铵分级沉淀、PhenylSepharoseFF疏水层析、OSepharoseHP阴离子交换层析、SuperdexⅢ200凝胶柱层析、冻干等技术，最终得到电泳纯的酯酶。SDS．PAGE电泳结果表明，该酯酶表观分子量为71KDa。以a．乙酸萘酯为底物对酯酶进行了理化性质的初步研究，结果表明：酯酶的最适反应温度为50。C，最适pH值为8．0，属于热稳定性良好的碱性酯酶。以壳聚糖、聚乙烯醇(PVA)、戊二醛等为材料，利用吸附、交联的原理，通过冻干技术制备了冻干．PVA．壳聚糖固定化酯酶。并通过单冈素优化实验，确定了固定

3、化酶生产的适宜条件：壳聚糖浓度3％、PVA浓度3∥L、酶液固定化载体体积质量比5／2ml／g，戊二醛浓度0．4％，交联时间30min，此时同定化酶活力回收率为73．8％。酯酶经固定化后，热稳定’H-茅il抗睃碱能力有明_5II!提升；在60℃，pH7．0的反应体系中活性最大；使』{j5次后，固定化酶载体形状基本没变化，活性保留了71％。利用冻干．PVA．壳聚糖固定化酯晦来降解农药西维因，并通过诈交试验，得出了降解反应的最佳条件，即在pH7．0、温度60℃、加酶量O．49、反应70min时，固定化酶对西维因的降解率达到最大值83．4％。在酯酶降解西维因的反应体系中，加入不同的会属离子，

4、会对降解率有所影响，其中，K+、Ca2+对降解反应有一定的促进作用，而Ag+、Fe”的抑制作用最为显著。利用冻干．PVA．壳聚糖固定化酯酶水解D．泛解酸内酯、用HPLC对反应过程进行监控，并通过单因素试验对水解反应条件进行了优化，得出了最适水解条件：搅拌速率150r／min，固定化酶59、反应时问6h，反应温度400C，在此条件下，海洋芽孢杆菌MP．2酯酶的分离纯化、同定化及应用研究D．泛解酸内酯的水解率达到最大值21．08％。在此基础上，研究了固定化酶对L．泛解酸内酯的水解反应和DL．泛解酸内酯的拆分反应，在最适条件下，L．泛解酸内酯的水解率<1．O％；DL．泛解酸内酯的底物水解率

5、为10．03％，产物对映体过量值(e．c．％)为92．57％。本研究成果为海洋芽孢杆菌MP．2酯酶在农药降解及手性拆分领域中的应用奠定了一定基础，因而在经济、社会和学术研究等方面具有重要意义。关键词：酯酶固定化酶活力回收率降解手性拆分青岛科技人学研究生学位论文StudyonthePurificationandImmobilizationofanEsterasefromMarineBacillusMP一2anditsApplicationABSTRACTMicrobialesterase，asanimportantindustrialenzyme，hasextensivepotenti

6、alforapplicationsinthefieldsoffood，chemicalindustry,medicine，environmentandmilitaryaffairs．Basedonthepreviousstudies，thisexperimentfocusedontheseparationandpurificationofesterase，itsenzymologycharacteristic，andimmobilization．Thisexperimentalsopreparedthefreeze-PVA·chitosanimmobilizedesterenzyme

7、s，whichusedchitosan，PVA，glutaraldehydeetcasmaterial．Atthesametime，itsapplicationinpesticidedegradationandchiralresolutionandotherareasbeenexploredsystematically．ThefermentationliquidofBacillusMP-2wascentrifugatedunderthefollowingc