产青霉素酶枯草芽孢杆菌的分离、纯化及相关酶活性的检测.doc

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1、产青霉素酶杆菌的分离、优化及酶活力的检测一、实验目的1、了解采集土样的要求和方法。2、掌握由土壤中分离产青霉素酶的基本原理和操作技术。3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。4、学习并掌握细菌培养基的制备。5、学习并掌握细菌发酵液产酶活性的检测方法。二、实验原理青霉素酶(EC3.5.2.6)是催化水解青霉素β-内酰胺环,使青霉素变成无抗菌活性的青霉素酮酸的一类β-内酰胺酶。早在1940年青霉素还未广泛应用于临床时,Abraham等就从耐青霉素的E.coliK12中发现了青霉素酶,该酶也是关于Β-内酰胺酶的首次报道。随后在地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌中相继发现

2、了这种特性的青霉素酶。并对地衣芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌产青霉素酶的发酵条件、酶学性质和基因序列进行了研究。虽然细菌产生青霉素酶是导致出现耐药性的原因之一,但利用青霉素酶具有水解β-内酰胺类抗生素的特点,可将其用于抗生素药品质量检验和新抗菌药物筛选。该酶最具广阔应用前景的用途是用于对牛奶中的青霉素残留量的快速定量测定和对青霉素超标牛乳进行处理。国外在20世纪80年代中期就开展了青霉素酶固定化及处理青霉素超标牛乳的研究,近年对青霉素酶生物传感器的研究非常活跃。另外,由于青霉素酶具有价格低廉和灵敏度高等优点,其可在酶联免疫吸附试验(ELISA)中替代传统的辣根过氧化物酶

3、和碱性磷酸酶。我国在青霉素酶的研究方面起步较晚。1999年,中国药品生物制品检定所在我国最先分离出一株能产生青霉素酶的蜡状芽孢杆菌CMCC(B)63301,并对该酶的发酵方法、水解酶谱和保存稳定性等方面进行了研究。该菌株作为青霉素酶产生菌已被收入中国药典。但目前国内在青霉素酶的研究和应用方面的报道较少。枯草芽孢杆菌芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长

4、时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5'-核苷酸酶的菌种。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。　枯草芽孢杆菌的作用机理：1、枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；2、枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，

5、促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长；3、刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力；4、枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用；5、能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞。三、实验材料1.溶液和试剂牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、硫酸铁、1mol/L氢氧化钠、1mol/L盐酸、琼脂、枸橼酸钠、K2HPO42．仪器和其他用品试管、三角瓶、烧杯

6、、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（pH5.5—9.0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、移液枪（20μL、200μL、1000μL）、枪头四、实验步骤及结果注意：所有试验操作均要在无菌条件下进行，防杂菌污染。（1）操作在无菌室，吴俊祥，超净工作台上进行，双手用70-75%酒精棉球擦拭。（2）培养容器（试管，培养皿等）要事先灭菌，培养时加盖。（3）接种用具要灭菌。试验流程：时间安排：5月16日：采集土样（缙云山土，沙土，泥土）。5月19日：土样稀释、倒平板、接种。5月21日：初选菌落，培养24小时。5月22日：配制含有10000单位/mL青

7、霉素的平板5个，将4000单位青霉素的平板上的菌落转接到10000单位/mL青霉素的平板上，30℃培养24小时。5月23日：配制含有20000单位/mL青霉素的平板4个，转接，30℃培养24小时。5月24日：选出生长较好的12株菌，接种到含有20000单位/mL青霉素的液体培养基试管，摇床培养24小时。5月25日：观察发现只有一支试管（沙3）中液体出现浑浊，保存菌种于一支斜面。5月28日：又发现了3支试管中液体出现浑浊，并将他们保种于斜面。将沙3的菌种取出1mL接到含1万单位青霉素的摇瓶,1mL接到含2万单位青霉素的摇瓶中，摇床培养24小时。同时将3支浑浊试管中

8、的菌液各取出1mL接到含