内质网分子伴侣在大肠杆菌对人脑微血管内皮细胞侵袭过程中的变化

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1、中国医科大学硕士学位论文内质网分子伴侣在大肠杆菌对人脑微血管内皮细胞侵袭过程中的变化姓名：任治远申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：陈誉华20040501中文摘要背景及目的新生儿细菌性脑膜炎是中枢神经系统最严重的疾病之一，大肠杆菌(Escherichiacoli，E．coli)是引起脑膜炎最常见的革兰氏阴性细菌。脑膜炎的发病率和致死率都很高，目前认为，E．coli经血源播散入脑，但其如何穿过血脑屏障，迄今尚不清楚。血脑屏障主要由脑微血管内皮细胞，内皮细胞间的紧密连接，以及包绕内皮细胞的基膜和星形胶质细胞的足突组成，以严格限制致病因子及细胞进入脑内。人脑微血

2、管内皮细胞(HBMEC)是构成血脑屏障的主要成分之一，体外分离培养的HBMEC已被视为研究细菌穿过血脑屏障机理的理想模型。探讨E．coli与脑微血管内皮细胞相互作用及E．coli侵袭脑微血管内皮细胞机制可望为新生儿细菌性脑膜炎的防治提高新的干预靶点。我们设想，E．coli的侵袭使人脑微血管内皮细胞处于应激状态，应激可能会使细胞内应激蛋白家族成员——内质网分子伴侣如葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、葡萄糖调节蛋白94(GRP94)发生变化。鉴此，我们以血脑屏障的主要组成成分人脑微血管内皮细胞(HBMEC)为血脑屏障模型，检测了内质网分子伴侣在E．coli侵袭HBME

3、C过程中的表达和分布情况，同时为了解内质网分子伴侣在E．coli侵袭HBMEC过程中变化的意义，我们也初步检测了在E．coli侵袭过程中与侵袭相关的发挥细胞粘附作用的骨架相关蛋白vinculin的变化，希望为探讨E．coli的侵袭HBMEC机制和血脑屏障功能的研究积累科学资料。方法1．利用RT—PCR方法检测E．coli侵袭HBMEC过程中GRP78、GRP94mRNA的表达变化。2．应用蛋白质免疫印迹(WesternBlot)方法检测E．coli侵袭HBMEC过程中GRP78、GRIX)4蛋白的表达改变。3．利用免疫荧光方法分析GRF78、GKF94蛋白在大肠杆

4、菌侵袭后在·1·HBMEC中的分布情况。4．应用蛋白质免疫印迹(WesternBlot)方法检测E．coli侵袭HBMEC过程中vinculin蛋白的表达改变。结果1．GRP78、GRP94在人脑微血管内皮细胞内存在基础表达。2．人脑微血管内皮细胞在大肠杆菌E44侵袭前后，其细胞内GRP78的mRNA和蛋白水平无明显改变。3．在大肠杆菌E44侵袭前后，人脑微血管内皮细胞内GRI习4的表达存在明显的差异性，侵袭后较侵袭前GRP94的mRNA和蛋白水平下降，并且随着侵袭时间的延长，二者的表达量也随之减少。4．免疫荧光结果显示，在正常的HBMEC中，GRI叩8和GRP9

5、4的免疫反应阳性信号主要分布在细胞浆中，当大肠杆菌E44侵袭HBMEC后，GRW8的含量和分布未见明显变化，而GRf94的含量随着侵袭时间的延长逐渐减少，并且其分布向胞膜附近转移。5．人脑微血管内皮细胞在大肠杆菌E44侵袭前后，其细胞内Vinculin的表达存在明显的差异性，侵袭后较侵袭前Vinculin的蛋白表达水平上升，并且随着侵袭时间的增加，表达量也随之上升。结论1．内质网分子伴侣GRIX)4涉及到大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞过程，其作用机制似与vinculin的表达相关。2．内质网分子伴侣GRP78没有参与到大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞的过程。关键词：

6、大肠杆菌；血脑屏障；人脑微血管内皮细胞；葡萄糖调节蛋白78、94：vinculin·2·ChangeofEndoplasmicReticulumMolecularChaperoneinTheProcessofEscherichiacoliInvasiontoHumanBrainMicrovascularEndothelialCellsAbstractObjectiveTheblood—brainbarrier(BBB)isformedbythecomplextightjunctionsbetweentheendothelialceltsofthebraincapi

7、llaries．ThisstructureresultsinthecapiUarywallthatbehavesasacontinuouslipidbi—-layercontrollingtheac·-CeSSofsolutesandtoxicsubstancestothecentralnervoussystem(CNS)SOastomaintainbrainhomeostasis．So，studyofhumanbrainmicrovascularendothe-lialcell(HBMEC)willleadUStounderstandtheregulativer

8、aecha