β淀粉样蛋白上调人脑微血管内皮细胞CCR5表达的机制及意义

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1、·中文论著摘要·p．淀粉样蛋白上调人脑微血管内皮细胞CCR5表达的机制及意义目的在老年人中，阿尔茨海默氏病(AD)是痴呆发生最为常见的原因，在美国人的死因中占第四位。它的临床特征包括进行性的痴呆，渐进的认知能力下降。它主要的神经病理特征包括老年斑、神经纤维缠结及神经元和突起的丢失。老年斑和脑血管内沉积的主要成份是p．淀粉样蛋白(Ap)，它由39．43个氨基酸残基组成，是淀粉样蛋白的前体蛋白经过剪切形成。Ap的聚集被认为极可能是AD早期的必要因素。脑血管功能失调促进AD认知能力下降和痴呆的发生。血脑屏障主要由脑微血管内皮细胞、内

2、基膜和神经胶质膜构成，是脑和循环系统之间的一个代谢和生理性屏障结构，血脑屏障的功能在于阻止循环中的药物、毒素等外源物质入脑以保护中枢神经系统免受损害。体外分离培养的人脑微血管内皮细胞(舶砸cs)就成为研究血脑屏障功能的理想对象。近年的越来越多的证据表明，炎症机制在AD发病机制中起着至关重要的作用。趋化因子属于细胞因子家族，主要功能是募集单核细胞到炎症部位。趋化因子受体5(CCRS)是一种趋化因子的受体，免疫组织化学研究表明，AD病人A[3的沉积伴随活化的胶质细胞中CCR5表达增加，这提示CCR5在调节AD病人的免疫反应中发挥作

3、用。在我研究室以前的研究中，发现Ap能够上调HBMECS表面的CCR5蛋白表达，但其机制和意义并不清楚，本研究试图回答该问题。血脑屏障(BBB)通过内皮细胞上的晚期糖基化末端产物受体(RAGE)和低密度脂蛋白受体相关蛋白．1(LRP．1)运输Ap。RAGE是细胞表面分子免疫球蛋白超家族的一员，能够与Ap相互作用，是与AD发病相关的一个重要蛋白。在构成血脑屏障的内皮细胞上，AB与RAGE相互作用引起循环中的Ap通过跨细胞作用进入脑内。在AID病人的脑内，RAGE的表达增加，使得进入脑内的Ap增加并且在脑内聚集，这与AD的发病机制

4、相关。近年证实RAGE存在几种亚型，它们编码缺少了跨膜和胞浆段的截短的RAGE，这些分泌型的RAGE能够与RAGE的配体结合，抑制RAGE的配体和受体相互作用，进而抑制配体／受体轴的信号传递，这为我们寻找预防和治疗AD的有效方法提供一些新的思路。那么A13是通过什么信号通路上调HBMECs上的CCR5表达?CCR5表达上调有什么重要的生物学意义呢?运输循环系统中A13进入中枢神经系统(CNS)的RAGE是否参与了CCR5表达上调的过程呢?这些问题与AD病人的发病机制密切相关，解决上述问题可望为我们寻找预防和治疗AD病人的医疗方

5、案积累一定的理论基础。因此，本文主要针对解决上述问题展开相关的实验。方法一、研究AP上调HBMEcs上CCR5表达的细胞内分子机制(一)细胞培养HBMECS培养于含10％胎牛血清和10％新生牛血清的RPMll640培养液。(二)荧光实时定量PCR法检测不同浓度和不同时间的AD对HBMECs上CCR5mRNA表达的影响。(三)Western．blot方法检测不同浓度和不同时间的Ap对HBMECs上CCR5蛋白表达的影响。(四)Western．blot方法检测Ap对MAPK／P13K信号通路的影响。(五)Western．blot方

6、法检测Ap对HBMECs上Egr·1表达的影响。(六)染色质免疫沉淀法检测转录因子Egr-1与CCR5启动子的结合情况。2(七)建立Egr-1干扰的HBMECs细胞株Egr-1siRNAs稳定转染HBMECs的细胞株，并用western-blot方法鉴定及检测CCR5的表达情况。二、探讨RAGE受体在Ap上调HBMECs表面CCR5表达过程中的作用(一)应用RT．PCR方法分析不同浓度和不同时间A[3对HBMECs上RAGEmRNA表达的影响。(--)应用Westem．blot方法分析不同浓度和不同时间Aft对HBMECs上R

7、AGE蛋白表达的影响。(三)应用Western．blot方法检测RAGE中和抗体对A13通过MAPK／P13K信号分子上调CCR5表达的影响。(四)真核表达载体构建，脂质体稳定转染HBMECs，建立过表达RAGE的HBMECs细胞株(即HBMECRAGE+)。1、重组质粒pUCmT-RAGE的构建。2、真核表达载体构建。3、稳定转染HBMECs细胞株。(五)真核表达载体构建及稳定转染细胞方法建立RAGE胞内段缺失的HBMECs细胞株(即HBMECc劬眦dRAGE)和RAGE胞外段缺失的HBMECs细胞株(即HBMECN拙删RA

8、GE)。方法同上(六)应用Western．blot方法检测Ap对HBMECRAGE+、I-lBMECc-仇mcate．dRAGE和HBMECN劬。砌RAGE上CCR5的蛋白表达的影响，同时检测后两种转染了截短型RAGE细胞中MAPK和AKT信号分子的表达情况。三、研究Ap上调