四物汤对血虚证小鼠细胞凋亡影响的研究

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1、广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不合任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名量垂至1日期：扫7午年6月多日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构途交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权广州中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检

2、索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名±正墨2论文导师签名日期：2。I午年舌月箩日摘要目的：观察四物汤对血虚证小鼠肝细胞、T细胞凋亡及凋亡相关基因Bax、Bcl一2和Fas表达和凋亡启动分子Caspase8、执行分子Caspase3表达的影响。方法：60只C57BL／6J小鼠随机分为空白组、模型组、四物汤低剂量组、四物汤中剂量组、四物汤高剂量组以及肌苷组。以腹腔注射环磷酰胺建立血虚证模型。模型组、四物汤低、中、高剂量组及肌苷组于实验第ld按小鼠体重0．19／kg剂量腹腔注射环磷酰胺1次，空白组予等体积生理盐水腹腔注射。四物汤低

3、剂量组予59·kg～·d～、中剂量组予lOg·kg～·d～、高剂量组予209·kg～·d。1灌胃，肌苷组予0．06g·kg一·d1灌胃。空白组和模型组则予以等体积生理盐水。每日1次，连续灌胃7d。在实验第7d，给药1h后，每只小鼠眼眶后静脉丛取血，采血量约0．1mL，采用全自动血液分析仪检测外周血象。在实验第8d，颈椎脱臼处死小鼠，剖腹取肝脏、脾脏及胸腺。称量脾脏及胸腺质量以计算脾指数及胸腺指数。肝右叶切取1．OcmX1．OcmX1．Ocm组织块，以10％甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，TUNEL法检测肝细胞凋亡。取脾脏制备淋巴细胞悬液，免疫磁珠法分离纯化T细胞，制作细胞涂片，TUNEL法检

4、测T细胞凋亡。取肝左叶-80℃保存，以备用于总RNA和蛋白提取。荧光定量PCR法检测Bax、Bcl一2及FasmRNA表达。先将RNA逆转录cDNA，反应条件为，25。C温育lOmin，42℃温育50min，95℃加热5min。再取cDNA进行PCR，反应条件为95。C预变性2min，95。C变性30s，58℃退火30s，72℃延伸lmin，反应35个循环。循环结束后，72℃延伸5min。采集每个样品Ct值，比较各组的mRNA表达水平。Westernblot检测Caspase3、Caspase8表达。先制备SDS-PAGE凝胶，10％分离胶8mL和5％浓缩胶4mL。室温放置40min至胶凝

5、固。再将样品蛋白和电泳上样缓冲液混合，进行蛋白变性，反应条件为95℃lOmin，然后做蛋白电泳。接着将蛋白转至PVDF膜上，反应条件为65V，2h。取出转移膜置于封闭液中，封闭1h。将封闭后的膜放入一抗中，4℃反应过夜。将反应膜用1×TBST洗涤，洗涤3次，每次10min。将洗涤后的膜放入二抗中，室温孵育1h。再用1XTBST洗涤，洗涤3次，每次10min。以电化学发光法显影，再曝光及洗片，采用凝胶成像系统，对胶片进行扫描，检测条带灰度值，做蛋白半定量分析。结果：(1)外周血象：与模型组比较，四物汤中、高剂量组及肌苷组外周血红细胞数、白细胞数以及血红蛋白含量均有升高，P<0．05，有统计学

6、意义。四物汤低剂量组外周血红细胞数、以及血红蛋白含量均有升高，P<0．05，有统计学意义，白细胞数有上升趋势，P>O．05，无统计学意义。四物汤各剂量组血小板数有上升趋势，P>O．05，无统计学意义。肌苷组血小板数有下降趋势，P>O．05，无统计学意义。(2)脏器指数：与模型组比较，四物汤低、中、高剂量组及肌苷组脾指数均有升高，P<0．05，有统计学意义。四物汤低剂量组胸腺指数有升高趋势，P>O．05，无统计学意义。四物汤中、高剂量组及肌苷组胸腺指数有下降趋势，P>O．05，无统计学意义。(3)细胞凋亡百分率：与模型组比较，四物汤低、中、高剂量组肝细胞凋亡百分率均降低，P<0．05，有统计

7、学意义。肌苷组肝细胞凋亡百分率有下降趋势，P>O．05，无统计学意义。四物汤中、高剂量组T细胞凋亡百分率均降低，P<0．05，有统计学意义。四物汤低剂量组和肌苷组T细胞凋亡百分率有下降趋势，P>O．05，无统计学意义。(4)凋亡相关基因mRNA表达：与模型组比较，四物汤高剂量组和肌苷组促凋亡基因Bax和FasmRNA表达水平降低，P<0．05，有统计学意义。四物汤低剂量组和中剂量组Bax和FasmRNA表达水平有下降趋势