维生素a酸对小鼠囊胚细胞凋亡的影响

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1、维生素A酸对小鼠囊胚细胞凋亡的影响【关键词】细胞凋亡　全反式维生素A酸　囊胚　小鼠　　RetinoicAcidAffectsApoptosisinMouseBlastocys　　AbstractObjective：ToobserveapoptosisinICMandTEinducedbyalltransretinoicacid(ATRA)inmouseblastocystsinvitro.Methods：Mouse3.5dblastocystsol/l,1μmol/land10μmol/lalltransretinoicacid

2、,FixedblastocystsobservedfortheirapoptosisbymeansoftheterminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddUTPnickendlabeling(TUNEL).Results：ATRAcaninduceapoptosisinTEandICMcellsofmouseblastocysts.Conclusion：ThisstudyexaminedthecytotoxiceffectofATRAonmouseembryos.Keyouse　　维生素

3、A酸（retinoicacid，RA）是维生素A在体内的氧化代谢产物之一。按几何异构体的不同，其可分为全反式维生素A酸（alltransretinoicacid，atRA）、9顺式维生素A酸（9cisretinoicacid，9cRA）和3，4双脱氢维生素A酸(3，4didehydroretinoicacid，ddRA)。维生素A酸是公认的致畸因子，几乎所有常见的维生素A酸均可诱发实验动物的先天畸形，并且不同结构的维生素A酸的致畸作用强度有很大的区别，其中以全反式维生素A酸的致畸作用最强［1］。国外有资料显示体外培养的小鼠囊胚用

4、过量的RA处理后，会导致胚胎生长发育迟缓而着床失败或着床后胚胎死亡。RA对囊胚的这种致畸效应可能由于其诱导ICM和ＴＥ细胞过渡凋亡所致，而RA诱导囊胚细胞凋亡国内目前尚未见报道。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1试验动物　　一级健康昆明种小白鼠（SPF级），由武汉大学医学院动物试验中心提供。　　1.1.2主要试剂和仪器　　孕马血清（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）为天津生物制品厂产品；ATRA购自上海第六制药厂；M199培养基为美国Hyclone公司的产品；TUNEL试剂盒购自宝灵曼公司；激光共聚焦扫描显微镜型号为

5、LeicaDMIRE2。　　1.2方法　　1.2.1小鼠囊胚的获取　　选用一级健康昆明种小白鼠,雌雄各30只,鼠龄8～10周，体重30±5g。雌鼠腹腔注射10UPMSG，48h后再腹腔注射10UhCG促超排卵,当晚与雄鼠1:1合笼。次日晨检查阴栓，见阴栓者记妊娠0天。于妊娠3.5d时，将孕鼠脱臼处死，由阴道端插入7号针头注入M199培养基，冲出早胚。将所有的早胚冲入凹皿中，并用PBS洗涤囊胚。选取扩张期囊胚，并随机地用作不同实验。　　1.2.2胚胎培养　　将所有囊胚随机分为3组，即对照组和两个实验组，培养在35mmFalcon塑料培

6、养皿中，每皿加入1ml培养基。实验1组中加入1μmol/lATRA，实验2组中加入10μmol/l的ATRA，所有ATRA均溶于0.02%的DMSO。对照组只加等量的0.02%DMSO。并置入37℃、5%CO2培养箱内培养24h后，吸出囊胚，并用PBS洗涤，随后立即固定于4%多聚甲醛，再用PBS洗涤3次，最后转到涂有多聚赖氨酸的玻片上，干燥24h待用。　　1.2.3TUNEL荧光标记检测　　将载有囊胚的玻片置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上，选用40×物镜,采用单一绿色荧光通道观察,激发波长为488nm,在530nm波长以上扫描观察。

7、每张玻片选取荧光表达最强的3～5个视野观察并由计算机自带扫描分析软件测定荧光强度与面积。上述指标的荧光值=平均荧光强度×平均荧光面积。　　1.2.4结果判断　　TUNEL法:荧光显微镜下见黄绿色荧光为阳性。每张玻片选取3～5个视野进行荧光强度的定量分析,结果以荧光值表示。　　1.2.5统计学处理　　测定结果以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS11.5统计分析软件对数据进行单因素方差分析和q检验比较组间差异，以P<0.05为有统计学差异。　　2结果　　2.1激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡每张标本滴加带有FITC标记的TUNEL

8、反应液后,FITC与凋亡细胞的细胞核特异性结合，在激光下发出黄绿色荧光。对照组和试验组均可见黄绿色荧光,即为凋亡的囊胚细胞,对照组凋亡细胞数量很少。试验1组凋亡细胞数较少，试验2组凋亡细胞数量明显增多，经单因素方差分析，组间有显著性差