小鼠血虚证造模方法的比较及四物汤的反证

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1、小鼠血虚证造模方法的比较及四物汤的反证分子生物实验研究部分2002207122岑川第四组摘要：目的：观察和比较乙酰苯肼和环磷酰胺两种不同造小鼠血虚模型方法的差异性和检查同一基因在不同动物模型中的表达差异以及四物汤治疗的效果。实验方法：通过正常组、乙酰苯肼组、环磷酰胺组、四物汤组这四组组织切片的观察比较来评价血虚造模方法，及通过RT-PCR法来检测肝组织同一基因的表达差异。结果：环磷酰胺和乙酰苯肼均有造血虚的作用，四物汤促进血虚证小鼠肝组织基因的表达可能是其生血作用的机制之一。关键词：血虚环磷酰胺乙酰苯肼四物汤RT-PCR法基因表达近年来,随着对血虚证研究的不断深入,对血虚证动物模型的研究也

2、有新的进展。尽管动物模型在当前还不能准确反映人体血虚证的全部实质,但作为替代实验对象,已在血虚证发病机制探讨及中药治疗研究等方面发挥了重要作用。乙酰苯肼和环磷酰胺造模都是血虚造模常用的发法，但由于机制不同，所以有各自不同的特点。一实验器材和实验方法75%乙醇、氯仿、异丙醇、Trizol、RNAsin(40Ｕ/u)、DNTP（10mＭ）、EB（2mg/ml）、5*TBE、琼脂糖、上下游引物、随机引物（100ug／ul）、20，200，1000u移液枪、电动匀浆机及匀浆管、冷冻式离心机、离心管、电泳仪、PCR仪、剪、镊等正常小鼠组、环磷酰胺造模小鼠组、乙酰苯肼造模小鼠组、四物汤治疗小鼠组各十只

3、煎药：四物汤（生地.白芍.当归.川芎各3g),共煎成药汁130ml灌胃给药：治疗组小鼠每天给药四物汤一次，共七天。前两天每次每只小鼠给药1ml，后五天每次每只小鼠给药0.5ml，其余３组小鼠后四天每只加灌0.5ml生理盐水。RNA提取1.取各组实验组任一只小鼠肝组织50-100mg,剪碎，加入1mlTorizol液，快速电动匀浆2.22度，静置5min3.加入氯仿0.2ml,颠倒15s4.22度，静置3min5.离心：4度，15000转/分*15min6.取上清液0.5ml(含提取的RNA）7.加入适量异丙醇，混匀8.22度，静置10min9.离心：4度，15000转/分*10min10.

4、弃上清液11.加入1ml4度75%乙醇（提纯RNA，释放异丙醇）12．离心：４度，10000转／分*５min13．弃上清液，真空干燥５min14．用25ul水溶解，－７０度保存反转录５＊ｂｕｆｆｅｒ４μlＤＮＴＰ（１０ｍＭ）２μl随机引物（１００ｕｇ／μl）１μlＤＴＴ（１００ｍＭ）１μlＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／μl）１μl总ＲＮＡ（２ｕｇ）水至１８μl６５度，５分钟，冰上，加ＲＮＡｓｉｎ１μl，Ｍ－ＭＬＶ１μl。３７度６０分钟，９４度５分钟。－２０度保存。PCR白蛋白葡萄糖醛酸ＤＮＴＰ（μl）２０２０１０＊ｂｕｆｆｅｒ（μl）２０２０ＭｇＣｌ２（μl）２０２０上，下游引物各（μl）２０２０

5、Ｔａｇ酶（μl）２２ＲＴ产物４管（０．４μl每管）４管加水至（μl）１００１００ＰＣＲ反应条件为：９４°C３ｍｉｎ－－９４°C４５ｓ，５５°C１ｍｉｎ，７２°C４５ｓ，３０个循环－－７２°C５ｍｉｎ－－４°C保存电泳１．制作电泳凝胶模具２．电泳缓冲液：１＊ＴＢＥ２５０ｍｌ３．作１．４％琼脂糖凝胶（６０ｍｌ）４．制备样品，取２０μlＰＣＲ样品，加４μl加样缓冲液，混匀，依次上样：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ６μl正常组２４μl模型组２４μl治疗对照组２４μl５．电泳：８０Ｖ，０．５－１小时６．紫外灯下观察目标基因片断，进行拍照二实验结果（一）肝、胃、小肠组织切片观察肝（х400倍）环磷酰胺组乙酰苯肼组

6、四物汤组正常组胃（х400倍）环磷酰胺组乙酰苯肼组四物汤组正常组小肠（х400倍）环磷酰胺组乙酰苯肼组四物汤组正常组（二）电泳实验结果Ⅰ葡萄糖醛酸组正常组乙酰苯阱组环磷酰胺组四物汤组亮度+++++照片从右至左分别为ｍａｒｋｅｒ，正常组，乙酰苯肼组，环磷酰胺组，四物汤组说明：该组图片除正常组较亮外，其他组均不显著。Ⅱ白蛋白组正常组乙酰苯肼组环磷酰胺组四物汤组亮度＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋照片从右至左分别为ｍａｒｋｅｒ，正常组，乙酰苯肼组，环磷酰胺组，四物汤组说明：与正常组相比，模型组较暗，治疗组亮于正常组。(三)讨论：A组织切片观察的讨论从肝脏的四张切片来看，正常组的肝组织正常，环磷酰胺和乙酰苯

7、肼致血虚组小鼠肝组织有明显损伤，细胞破裂，或肿大以致细胞形状有不等程度的改变，乙酰苯肼组血细胞数量较环磷酰胺组少，这正可能与乙酰苯肼溶血性贫血造血虚机制不同有关，但有待进一步探讨。治疗组较模型组肝组织有明显的改善。从胃的四张切片来看，正常组小鼠胃粘膜各层结构正常。环磷酰胺和乙酰苯肼致血虚组小鼠胃组织出现不同程度的损伤，胃壁细胞形状颜色都有一定程度地改变，四物汤组较模型组有所改善。但每组切片都能看到有少许的炎症渗出物，尤以