猪链球菌2型mrp和sspa抗原表位预测与表达及其免疫特性

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1、华中农业大学硕士学位论文猪链球菌2型MRP和sspA抗原表位预测与表达及其免疫特性姓名：吴立志申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：伍晓雄；沈志强201206猪链球菌2型MRP、sspA抗原表位预测与表达及其免疫特性摘要本研究的目的在于获得可抵御强毒猪链球菌2型(streptococcussuistype2,SS2)感染的保护性抗原肽，并分析其免疫特性，以期为研制低毒、高效的SS2蛋白亚单位疫苗提供科学依据。选取具有保护性或者具有重要免疫作用的蛋白一一溶菌酶释放蛋白(muramidase．releasedprotein，MRP)和枯草杆菌素样蛋白酶(subtilisin．

2、1ikeserineprotease，sspA)。参考NCBI蛋白质数据库中MRP、sspA氨基酸序列和结构信息，避开蛋白的毒力结构域、舍弃信号肽段、去除膜锚定结构域和处于膜内(胞浆)的肽段。运用蛋白分析软件ANTHEPROT5．0对蛋白的二级结构(螺旋、折叠、转角、无规卷曲)和B细胞表位进行综合预测与分析(亲水性、疏水性、抗原性、跨膜结构、溶剂可及性等)，确定蛋白的B细胞优势表位簇。使用Oligo6．0和Primer5．0设计出两端带合适酶切位点的引物并通过PCR获得预测的抗原肽段基因，酶切连接插入原核表达载体pET32a，导入表达菌株BL21表达菌株，构建重组抗原的原核表达

3、系统。IPTG诱导表达，以渗透性休克法和热休克法纯化重组蛋白；使用灭活SS2免疫血清Westernblot检测重组蛋白的免疫原性及其与SS2免疫血清的反应性。纯化的重组蛋白免疫雌性SPFCDl小鼠检测其安全性，用强毒SS2SDLVDU株攻毒重组蛋白免疫小鼠，评估重组蛋白的免疫保护效力。预测结果显示lVlRP的950"--1210aa肽段、sspA的91"-一323aa肽段为B细胞优势表位簇。构建了上述肽段基因与pET32a的原核重组表达系统，重组蛋白可溶性表达，微量蛋白测定仪测定表达量为10me；mL；Westernblot显示重组蛋白具有良好的免疫原性和反应性；免疫安全性试验

4、表明，MRP和sspA重组蛋白均安全可靠；免疫效力试验表明，lVlRP的950'---1210aa肽段重组蛋白对小鼠的免疫保护率为40％，为菌体免疫所提供保护率的50％；sspA的91～323aa肽段重组蛋白虽然对小鼠不产生保护力，但是可以延缓小鼠的死亡时间，与MRP的950～1210aa肽段重组蛋白共同免疫的保护率为60％，表现了协同保护作用。关键词：猪链球菌2型：溶菌酶释放蛋白；枯草杆菌素样蛋白酶；B细胞表位；原核表达；免疫保护AbstractThisstudyfocustheprepotentantigenicdeterminantofMRP(1ysozymereleas

5、eprotein)andsspA(subtilisin．1ikeserineprotease)，whichCanagainsttheinfectionofSS2(streptococcussuistype2)．MRPandsspACanprovideprotectionforceandagainsttheinfectionofSS2inthereportsintheliterature．GettheaminoacidsequenceinformationandstructuralinformationofMRPandsspAfromthedatabaseNCBI(Nationa

6、lCenterforBiotechnologyIformation)．Removesignalpeptidesandpoisonousforcestructure，gettheprepotentantigenicdeterminantbyusingANTHEPROT5．0toanalysethesecondarystructure(turning、foldin、helixandrandomcoil)、hydropHily、accessibilityandantigenicity；Thepredicted91---323aapeptideofsspA(sspA-1)and950．

7、1210aapeptideofMRP(mrp．1)prokaryoticexpressionvectorpET32a-prtS·1and力ET32a．mrp．1wereconstructedbyusinggeneticengineeringtheorymethodandthenpurifiedbyproteinpurificationkits；AnalysetheimmunogenicityandreactivitybyWesternblotanalysisusingthepurifiedM