口蹄疫病毒结构蛋白vp1病毒样颗粒构建及免疫研究

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1、万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料．与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：费I长时间：z。I)}年多月侈日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被查阅

2、和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容．(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：复^先摊各烨队时闻：切肜年‘月7夕日时间：刈牛年6月侈日万方数据l

3、UIIIIIIIMMImlIIIlY2697373本文是国家自然科学基金项目“o型口蹄疫病毒中和表位广谱保护性重建”(31260617)和农业部公益性行业(农业)科研专项“边境地区动物疫病防控技术体系研究"(201103008)的部分研究成果(项目编号：31060346)课题主持人：马文戈研究员(新疆维吾尔自治区畜牧科学院)万方数据口蹄疫病毒结构蛋白VPl

4、病毒样颗粒构建及免疫研究摘要口蹄疫病毒(FMDV)是小RNA病毒科(Picomaviridae)El疮病毒属(Aphthovirus)的成员，引起的I=1蹄疫(foot-and-mouthdisease,FMO)是一种急性、烈性、高度传染性的病毒病，主要感染牛、羊、猪、鹿等偶蹄类动物。本病除了直接引起幼畜死亡、减少动物体重和产奶量，还导致全球范围内动物及动物产品的国际贸易限制，造成严重的经济损失，是对偶蹄动物威胁最大的传染病。目前广泛使用的全病毒灭活疫苗在应用过程中发现诸多不足，开发新型疫苗来弥补这些不足显得极为迫切。FMDV结构蛋白VPl上存在重要的B细胞和T细胞表位参与构成主要抗原位点

5、。故本研究构建了基于VPl的融合蛋白病毒样颗粒(ⅥjPs)，来研究该融合VLPs的组装情况及免疫效果。本研究根据FMDVAsiaI／JS／C叫05序列和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)流行株BVDVJZ05．1序列，选择BVDV核心蛋白P14，第169-270位氨基酸和FMDV结构蛋白VPI的第l~2ll位氨基酸，两者之间设计柔性肽SGSPSGPGSG连接，通过融合PCR获取P14．柔性肽-VPI融合蛋白编码序列。全基因长988bp，克隆到链接有分泌信号肽的pBLRl8载体上构建成pBLRl8-p14-VPl质粒。从该质粒上获得分泌信号肽．P14-VPl基因，与枯草芽孢杆菌表达载体p7257-

6、P43连接，构建成表达质粒p7257-P43．P14-VPl。转化枯草芽孢杆菌WB800，经筛选、鉴定，获得表达P14．VPl融合蛋白的枯草芽孢杆菌。该芽孢杆菌在含有40Ftg／mL氯霉素的LB中培养后，菌液上清中可检测到目的蛋白。Westernblot结果显示，该蛋白能够特异性识别Asial型FMDV抗体。透射电镜观察显示，融合蛋白组装为直径约50nra大小的病毒样颗粒(VLPs)。将WB800表达的P14．VPl融合蛋白组装成的VLPs，与MONTANIDEISA206VG佐剂联合免疫小鼠，设灭活FMDV和PBS对照组。分别于免疫后0、2、4、6、8、lO、12、14、16周尾根静脉采

7、血分离小鼠血清，用间接ELISA和病毒中和试验检测体液免疫效果。与对照组相比，接种融合蛋白的小鼠能够产生ELISA抗体，但其血清无中和病毒的能力。关键词：Asial型12蹄疫病毒；病毒样颗粒；融合蛋白万方数据Constructionofvirus-likeparticlesjo￡structuralproteinvPloffoot-and—mouthdiseasevirusanditsimmunogenicityAbs仃actFMD(foot-and-mouthdisease，FMD)isallacute，severe，highlycontagiousviraldisease，whichc

8、ausedbyFoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)．ThevirusisamemberoftheAphthovirusinthefamilyPicornaviridae，whichaffectsanimalswi廿lclovenhoofedanimals,suchascattle,sheep,goats,pigs,anddeer．Inadditiontothedirectcauseofthep