新型肠道病毒89型结构蛋白vp1构建表达和序列研究

《新型肠道病毒89型结构蛋白vp1构建表达和序列研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、新型肠道病毒89型结构蛋白VP1构建表达和序列研究　　[摘要]目的研究克隆表达新型肠道病毒89型VP1结构蛋白，并进行活性鉴定和序列分析。方法分离肠道病毒89型VP1结构蛋白全基因，克隆入原核表达载体PET-28构建重组质粒pH-VP1，在大肠埃希菌BL21中进行表达，检测表达产物的特异性及活性。将EV89VP1核酸序列与Genbank数据库中的序列进行比对并建立系统进化树。结果重组质粒在1mmol/L的IPTG37℃诱导7h后可诱导表达得到约33kD的蛋白，经WesternBlot实验检测证明表达的融合蛋白具有EV89抗原的活性。分离的EV89病毒其VP1区核酸序列与G

2、enbank数据库中仅有的3株EV89序列同源性分别为86.4%、85.9%、85.6%。结论成功构建EV89重组蛋白，其表达产物具有良好的特异性及活性，可进一步用于VP1检测方法的研制。进化分析表明，分离的EV89VP1区与Genbank数据库中其他分离株亲源性较远。[关键词]肠道病毒89型；VP1蛋白；原核表达[中图分类号]R373.2[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2013）12（a）-0004-049肠道病毒自1969年首次被发现以来，在全世界引起了规模不等的爆发流行。自此，人们开始不断意识到肠道病毒所带来的严重公共卫生问题。在我国肠道病毒已成为对

3、中国人危害最大的疾病之一。近年来随着新型肠道病毒不断出现，肠道病毒的致病性已引起人们高度重视。科研人员针对各种肠道病毒的致病性、同源性鉴定等研究越来越多[1-5]。本研究对1例不明病因的急性肝炎同时出现肠道症状患者粪便标本中分离到的1株新型肠道病毒（EV89）进行了研究并进行相关序列分析，希望通过构建VP1结构蛋白，为下一步建立EV89抗体检测方法进行EV89病毒的流行病学调查及致病性研究奠定基础，希望通过序列分析揭示其遗传进化关系。1材料与方法1.1材料EV89病毒株分离自解放军三〇二医院住院患者粪便标本，病毒经空斑纯化后分装冻存于-80℃。RNA提取试剂盒购自QIAG

4、EN公司。胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、BL21（DE3）感受态细胞购自全式金公司。PCR相关试剂购自TaKaRa公司。1.2重组质粒的构建9根据Genbank中所报道的EV89病毒保守区VP1片段进行引物设计。上下游引物分别引入BamHⅠ和PstⅠ酶切位点（上游1F：5’-ggatccCGGTGATCCCATGGAAGAG；下游：1R：5’-ctgcagTCAAAGGTTCTTGATGTCAGCTCG）。以提取的EV89病毒为模板，利用一步法RT-PCR，扩增出全长的VP1基因。电泳检测正确后回收目的片段，送Invitrogen公司测序。BamHⅠ和PstⅠ酶切测序

5、鉴定正确的VP1基因片段后，胶回收纯化目的片段，与原核表达载体pET28a连接后转化大肠杆菌DH5α，扩增培养单克隆菌落并提取质粒，酶切和PCR分析鉴定正确的重组质粒，命名为pH-VP1。1.3重组蛋白的原核表达及纯化将重组质粒pH-VP1转化BL21（DE3）感受态细胞，挑取阳性克隆子用含100mg/mL氨苄青霉素的LB培养液培养过夜后，1∶100转接于新鲜液体LB中继续培养至OD/A600值达0.6，加入终浓度为1mmol/L的IPTG在37℃诱导蛋白表达。分别收取不同时间段的菌液，10000r/min离心10min收集沉淀，10倍浓缩溶于PBS（0.02mol/L）

6、中。反复冻融3次后超声破碎，用梯度离心法分别收取表达菌的菌液和沉淀。SDS-PAGE分别确定表达蛋白的最佳表达条件、表达特性（可溶性蛋白/包涵体）及表达量。取3mL表达产物用HIS标记蛋白微量纯化试剂盒纯化表达蛋白，具体操作步骤见试剂盒说明书（北京天恩泽基因科技有限公司）。1.4表达蛋白的活性鉴定将表达重组蛋白及空载体分别用抗HIS标签抗体和阳性患者血清转膜后做Western9Blot实验分析表达蛋白的特异性，具体操作为：将转膜后的硝酸纤维膜用30%的灭火牛血清封闭2h，加1∶20稀释的EV89患者血清，用酶标抗人IgG抗体作为二抗，TMB显色，初步鉴定重组蛋白的生物学活

7、性。取不同浓度咪唑洗脱的蛋白进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白纯度及纯化量。1.5遗传进化分析采用MEGA软件对EV89VP1区序列进行遗传进化分析。2结果2.1VP1全基因序列的扩增如图1所示，扩增出的EV89病毒VP1片段大小约900bp。回收纯化后测序结果分析表明，与EV89VP1基因同源性最高，没有核苷酸的位点突变，表明VP1基因扩增成功（图1）。2.2重组原核表达载体的构建VP1基因片段与原核表达载体pET28a连接转化后挑取单克隆菌落扩增培养并抽提质粒，BamHⅠ和PstⅠ酶切后，电泳结果显示有约3kb和900bp