肠道病毒71型vp1基因与2a基因和蛋白质特征

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1、中文摘要摘要肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属，感染后可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样麻痹性疾病、神经源性肺水肿等多种与神经系统相关的疾病。近几年在亚太地区的大流行中，出现严重中枢神经系统感染病例，甚至死亡病例，因此有关EV7l病毒的致病性、致病机理、诊断及疫苗方面的研究日益受到重视。国家卫生部已于2008年5月2日决定，将手足口病纳入传染病防治法规定的丙类传染病进行管理。EV71为什么会导致少数重症甚至死亡病例的出现，毒力决定因子有哪

2、些?EV71的VPl基因编码的蛋白质是病毒重要的中和抗原决定簇，VPl基因序列除了是肠道病毒属内不同血清型分类的依据，还可以作为小RNA病毒科内不同属的分类参考。研究表明EV71的11个病毒蛋白中，对酵母菌产生毒性的只有2A蛋白，而2A蛋白是水解酶，在正常的生理意义下，哺乳细胞被肠病毒感染后，宿主的生长会受到抑制，其中一个机制就是：2A蛋白切割分解宿主的真核生物起始因子4G(elF4G，eukaryofictranslationinitiatiOllfactor4G)，因而抑制宿主蛋白质合成。也有报道指出，d,JL

3、麻痹病毒的2A蛋白会抑制酿酒酵母(Saecharomycescerevisiae)的细胞生长，可能的原因是2A切割了一些用来进行转录的蛋白质因子。短暂的表达EV712A蛋白酶引起细胞凋亡，感染表达的EV712A会导致elF4GI的裂解，而elF4GI是宿主蛋白合成的关键因素。目的本课题旨在研究肠道病毒71型轻症和重症病例毒株VPl基因、2A基因的核苷酸序列及预测的2A蛋白质结构特征及是否有差别。方法通过RD细胞分离病毒，然后RT．PCR鉴别诊断EV71，分别扩增VPl、2A基因并进行核苷酸序列测定，用DNAMAN软

4、件进行同源性比较并构建系统发生树，通过同源建模用chimera软件将2A氨基酸序列预测出蛋白空间结构模拟图，探讨二级、三级结构是否有差异。克隆2A基因并构建EV712A基因的重组表达质粒plRES2．EGFP．2A。I中文摘要结果1．RD细胞的培养及病毒分离：成功培养RD细胞，无污染，接种后肠道病毒的致细胞病变(CPE)表现为：细胞圆缩、胞浆颗粒化、核固缩以及最后细胞破裂。2．RT．PCR鉴别诊断EV71：50份临床手足口病标本中有30份检测是EV71，其中轻型(手足口)13份，重型(手足口并发脑炎或心肌炎)17份

5、。3．VPl、2A基因的扩增：5株轻症和5株重症的标本经EV71VPl、2A基因特异性引物扩增，产物分别为1082bp、539bp。4．EV71病毒VPl、2A基因核苷酸序列测定与同源性比较、构建系统发生树：对扩增正确的10份PCR产物进行VPl基因和2A基因测序和遗传学分析，通过同源性比较和构建系统发生树发现，此10株EV7l病毒和中国大陆已发表的5株EV71病毒(fuyangEU703814．1、xianHM003207．1、shandongEU753418．1、shenzhenFJ607337．1、henan

6、GU366191．1)全部属于C基因型，且核苷酸同源性较高，VPI基因和2A基因的同源性分别在94．7％～99．4％和93．6％"-99．3％范围内。本次分离的10株EV71病毒与A、B基因型代表株比较，核苷酸同源性分别为81．0％'--84．6％和78．4％～82．2％，差异较大。与已知的C1、C2、C3亚型代表株比较，核苷酸同源性在87．8％,-一90．2％，差异之10％，与已知的C4亚型代表株比较，核苷酸同源性在96．8％'---99．6％，因此认为可将这10株病毒划分为C4亚型。在系统发生树上，这10株病毒

7、形成一个较独立的分支。5．2A蛋白空间结构模拟图：从重症57号和轻症20号的2A蛋白结构模拟图可以看出，57号有三个蛋白结构域与20号不同；其它4个重症(36、37、43、55号)和4个轻症(30、31、40、52号)患者病毒的2A蛋白结构也有一些不同，但没有发现轻、重症各自之间一致性的结构特征。6．2A基因克隆：经过PCR扩增和核酸测序证实，已成功获得2A基因。将空的T载体转入DH5a感受态细胞获得DH5a(T)。7．重组表达质粒pIRES2．EGFP．2A的构建：将轻、重型病例各一例分离的EV7l的2A基因DN

8、A插入plRES2．EGFP，成功构建重组质粒pIRES2-EGFP·2A，通过PCR扩增、双酶切和核酸测序已证实。结论1．本次分离毒株均属于EV71C基因亚型，且与中国大陆其他省区分离的毒株Ⅱ中文摘要遗传关系紧密。2．EV71VPl、2A基因分别在经测序的10个毒株之间遗传关系紧密且轻症和重症病例毒株之间均不存在差异。3．轻症、重症2A蛋白质二级、三级结构