抚顺市2014年肠道病毒71型vp1区基因特征分析

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1、抚顺市2014年肠道病毒71型VP1区基因特征分析　　摘要：目的探讨抚顺市2014年手足口病（HFMD）相同来源肠道病毒71型分离株（EV71）的VP1区基因特征。方法从2014年手足口患者20份咽拭标本中进行EV71病毒分离，随机挑取2株分离株经RT-PCR扩增VP1区，并对扩增产物进行核苷酸序列分析，构建2株分离株与各代表株间的基因亲缘性进化树。结果在对2株EV71进行VP1区基因测定显示：与C4亚型代表株的核苷酸序列同源性较高，在亲缘进化树上，属于C4基因亚型进化分支。结论从HFMD患者中分离出的EV71为C4基

2、因亚型进化分支，在亲缘性进化树中为紧密相连的一小簇，呈单源进化关系。　　关键词：肠道病毒EV71型；手足口病；基因特征　　AnalysisofGenotypeofVP1RegionofEnterovirus71inFushunCity，2014　　LIBing-jie　　（FushunCityHealthSchool，Fushun113006，Liaoning，China）　　Abstract：ObjectiveToinvestigatetheVP1genecharacteristicsofenterovirus71i

3、solate（EV71），thesamesourceofHFMDinFushunCity，2014.MethodsTheEV71viruswasisolatedfrom20swallowspecimensofhand，footandmouthin2014.TwoVP1isolateswereamplifiedbyRT-PCRandtheamplifiedproductswereanalyzedbynucleotidesequenceanalysis.TwoisolateswereconstructedGene-rela

4、tedphylogenetictreesbetweentheplantandtherepresentative.ResultsTheVP1geneoftwoEV71showedthatthenucleotidesequenceofC4subtypewashigherthanthatofC4subtype，andbelongedtoC4subtypeevolutionarybranchinkinshipphylogenetictree.ConclusionEV71isolatedfromHFMDpatientsisane

5、volutionarybranchofC4genesubtype，anditisasmallclustercloselyconnectedinphylogenetictree，showingasingleevolutionaryrelationship.　　Keywords：EnterovirusEV71；Hand，footandmouthdisease；Geneticcharacteristics　　?c道病毒71型（EV71）在分类上属于小RNA病毒科肠道病毒属，主要通过人群间的密切接触传播，也可经消化道传播，引起

6、手足口病（HFMD）、类脊髓灰质炎脑炎等疾病。尤其是手足口病，由于其传染性强、传播速度快、儿童病死率较高等特征，因此备受重视[1]，被列为国家法定传染病，并且近几年也已引起社会广泛的重视。据不完全统计，在丙类传染病中，HFMD报告发病数和报告死亡数均已跃居前位。为了解抚顺市手足口病基因特征，于2014年对HFMD患儿的咽拭子标本进行鉴定及EV71病毒进行了深入分析与探讨。　　1材料与方法　　1.1临床标本采集抚顺市某医院2014年6月～9月临床诊断为HFMD的20例患儿的咽拭子标本，装入特定采集管中，-70℃冰箱冻存备

7、用。　　1.2病毒分离鉴定将发病3d内的咽拭子标本分别接种于人横纹肌肉瘤细胞和非洲绿猴肾细胞中，每份标本在两种细胞中各接种3管，每天观察细胞病变，连续培养7d，并至少传2代，当出现细胞病变后，则使用荧光定量PCR（Realtime-PCR）方法进行鉴定。　　1.3病毒RNA核酸提取取收获的病毒上清液，使用核酸提取仪，应用MinibestViralRNAKit（TAKARA，Cat，No：DV818A）按照说明书进行提取病毒核酸。　　1.4病毒核酸PCR荧光检测应用肠道病毒EV71核酸试剂盒说明书进行PCR扩增，采用Re

8、altime-PCR方法检测，在PCR仪上进行荧光定量分析。　　1.5RT-PCR法扩增EV71病毒VP1区VP1区引物序列设计参见文献[2]，用全长VP1区基因片段EV71VP1F和EV71VP1R作为引物，在此扩增引物基础上进行RT-PCR，其反应条件：50℃30min、93℃3min、95℃30s、52℃30s、68℃2mi