利用转基因家蚕脂肪体表达口蹄疫病毒VP1蛋白的研究

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1、摘要利用转基因家蚕脂肪体表达口蹄疫病毒VPl蛋白的研究特种经济动物饲养硕士研究生幸俊逸指导教师夏庆友教授口蹄疫是由口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus，FMDV)所引起的偶蹄动物的一种急性、热性和高度接触性传染病，主要侵害偶蹄兽，偶见于人和其它动物。该病具有流行快、传播广、发病急、危害大等流行病学特点，疫区发病率可达50％．100％，严重危害畜牧业的生产。目前口蹄疫疫苗以灭活疫苗为主，但弱毒疫苗存在遗传不稳定性，在灭活过程中有可能损害或改变有效的抗原决定簇；产生的免疫效果维持时间短，不产生局部抗体；可能产

2、生毒性或潜在的对机体不利的免疫反应；需要多次注射，需要抗原量比较大，成本比较高。与之比较基因工程疫苗具有更高的安全性，成本较低，可大规模操作。家蚕是迄今唯一被人类完全驯化并得以充分利用的重要经济昆虫。利用家蚕丝腺、脂肪体等组织器官所具备的蛋白质高效表达和高等真核生物的翻译后修饰加工功能，可将其开发成为新型生物反应器，用于大规模、低成本生产有用蛋白。本研究以piggyBac转座子为基础，以含有主要抗原位点的O型121蹄疫病毒VPl结构蛋白基因为靶标，构建由脂肪体高量和特异表达基因LP3启动子驱动的pBac[3xp3-EGFP，LP

3、3-FMDV-VPl-SV40】表达载体，通过显微注射获得FMDV-VPl转基因蚕，研究在家蚕脂肪体表达动物疫病病毒抗原蛋白的可行性，为利用转基因蚕开发新型基因工程疫苗提供有用参考。lFMDV-VPl基因克隆和表达载体构建。基于FMDV-VPl基因序列，设计在5’端含BamHI限制性内切酶位点、3’端含ⅣDn限制性内切酶位点和6xHis标签的引物，通过PCR扩增获得大小为645bp阴雨大学硕十学位论文的目的片段，将其克隆至pMDl8一T载体并测序验证；然后以BamHI和ⅣDⅡ酶切并回收FMDV-VPl片段，克隆到pSL[LP3一

4、MCS·SV40]质粒载体，得到pSL[LP3一FMDV-VPl．sv40]；最后经AscI酶切，回收LP3．FMDV-VPl．SV40片段，连接到piggyBae基础载体pBac[3xp3EGFPaf]上，构建成家蚕脂肪体特异表达载体pBac[3xp3一EGFP，LP3·FMDV-VP1一SV40】。2转基因蚕的获得提取pBac[3xp3．EGFP，LP3-FMDV-VPl-SV40]表达载体的超纯重组质粒，将其与辅助质粒按1：1摩尔比混合至浓度为400ug／ul，注射已解除滞育的大造早期胚胎，在G1代胚胎期第5．7天置于荧光

5、显微镜下进行筛选。共检测蛾圈数34个，观察到荧光的蛾圈数为13个，阳性蛾圈率为38％。3转基因阳性个体的分子检测提取G1代转基因蚕蛾基因组DNA，分别进行反向PCR和Southern杂交检测，结果显示，我们成功的将2个转基因个体的插入位点，分别定位在第28号染色体蛾第16号染色体上，且外源基因插入拷贝数都为单拷贝。提取G1代转基因家蚕5龄4．7天时脂肪体组织的RNA。进行RT-PCR检测表明，由LP3启动的FMDV-VPl基因在脂肪体内高量转录表达，这与LP3启动子启动内源30K蛋白的表达情况一直，即5龄3天开始转录表达到吐丝前

6、后期达到最高点。4重组FMDV-VPl蛋白的蛋白质水平检测提取5龄第7天转基因家蚕脂肪体组织，溶于裂解液中，以非转基因大造家蚕为对照，采用商业化的6xHis标签抗体进行Westernblot检测。结果显示，在与目标蛋白大小一致的地方转基因家蚕脂肪体蛋白有明显的杂交信号产生而非转基因对照组无杂交信号，说明转基因家蚕脂肪体中成功表达了重组口蹄疫VPl蛋白。关键词：口蹄疫病毒家蚕转基因脂肪体ABSTRACTStudyonexpressingrecombinantfoot-·and··mouthdiseasevirusstructura

7、lproteinVP1bytransgenicsilkwormfatbodybioreactorCandidate：XinJunYiSupervisor：Prof．XiaQingyouABSTRACTFootandmouthdiseaseisaacute，pyreticandhigh—tangentinfectiousdiseaseofartiodactyls，whichiscausedbyfootandmouthvirus．ItviolatesartiodactylsviolateshumanandotheranimalsOc

8、casionally．ThecharacteristicsofFMDisfastpopular，widespread，acuteonsetandlargeharmful．Inaffectedareas，incidenceofFMDiscomeupto50％-10