口蹄疫病毒vp1基因重组腺病毒的构建与鉴定

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1、口蹄疫病毒VP1基因重组腺病毒的构建与鉴定作者：苏春霞，段相国，张艳丽，摆茹，陈溥言【摘要】目的构建表达O型口蹄疫病毒(Foot-and-MouthdiseaseVirus，FMDV)VP1基因的重组腺病毒并对其进行鉴定。方法将FMDVVP1基因克隆到腺病毒的穿梭载体pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP中。得到的阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后，利用电转化技术将线性化的阳性质粒与腺病毒骨架载体pAdenoVatorΔE1/E3共转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在大肠杆菌中进行同

2、源重组。将筛选到的重组病毒质粒经PacⅠ酶线性化后暴露出包装信号，通过脂质体LipofectamineTM2000转染HEK-293A细胞后得到重组病毒。利用报告基因GFP和细胞病变检测重组病毒滴度和感染效率，通过PCR和western-blot检测FMDVVP1基因在重组腺病毒中的表达。结果成功构建了表达FMDVVP1基因的重组腺病毒rAd5-VP1，其滴度为1011.87个TCID50/mL。western-blot检测重组腺病毒rAd5-VP1能与FMDV阳性血清发生反应。结论重组腺病毒rAd

3、5-VP1能与FMDV阳性血清发生反应，PCR和western-blot检测FMDVVP1基因在重组腺病毒中稳定表达。【关键词】口蹄疫病毒;重组腺病毒;VP1基因10口蹄疫(Foot-and-Mouthdisease，FMD)是由O型口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病，属于人畜共患传染病。该病的流行不仅造成巨大的经济损失，而且直接影响到国家贸易、人类生活和健康，关系到社会安定和国际声誉[1]。灭活疫苗的免疫接种是控制该病的主要方法，但只能提供短期保护，而且存在病毒灭活

4、不完全和病毒逃逸的潜在危险，因而基因工程疫苗的研究成为FMD研究的热点之一。随着分子生物学技术的飞速发展，FMD基因工程疫苗等多种新型的疫苗都在不断的研究开发中，但在动物保护性实验中的结果并不理想[2-3]。对O型FMDV抗原位点的研究表明，结构蛋白VP1-VP4均参与抗原位点的形成，但发挥主要作用的是VP1。VP1能诱导感染动物产生中和性抗体，它暴露于病毒颗粒的表面，易发生变异，在FMD基因工程疫苗研究中倍受关注[4-5]。本研究通过把O型FMDVVP1基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdenoVato

5、r-CMV5-IRES-GFP中，然后与骨架载体pAdenoVatorΔE1/E3在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，构建重组腺病毒并对其进行鉴定，为研究FMDV的重组腺病毒活载体疫苗奠定基础。　　1材料和方法　　1.1主要试剂腺病毒载体系统包括：穿梭载体pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP和骨架质粒载体pAdenoVatorΔE1/E3、宿主菌DH5α10和BJ5183均由南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室惠赠。含有O型FMDVVP1基因的质粒pMD18-VP1由本

6、人构建[6]。限制性内切酶PmeⅠ、PacⅠ购自Gene公司，其他限制性核酸内切酶、连接酶、聚合酶、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)，核酸分子量标准，DNA小量凝胶回收试剂盒均购自大连TaKaRa公司。LipofectamineTM2000购自上海Invitrogen公司，Western印迹试剂盒、HRP-SPA为武汉博士德生物工程有限公司产品;其它试剂均为国产或进口分析纯试剂。FMDV的标准阳性血清为中国农业科学院兰州兽医研究所产品。　　1.2方法　　1.2.1转移载体pA5-VP1的构建以pMD18

7、-VP1为模板，重新设计扩增VP1基因的1对引物(上海Invitrogen公司合成)。　　P1:5’-CGTAGATCTATGACCACCTCA-3’(BglⅡ)　　P2:5’-GCAGATCTCTCGAGTCAAAAAGCTGTTT-3’(BglⅡ，XhoⅠ)　　PCR产物和穿梭载体pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP分别经BglⅡ酶切，并于4℃过夜连接，氯化钙法转化大肠杆菌DH5α。提质粒用XhoⅠ进行酶切鉴定其正反向。将获得的阳性重组质粒命名为pA5-VP1，送上海Invitro

8、gen公司测序。10　　1.2.2pA5-VP1在大肠杆菌BJ5183中与pAdenoVatorΔE1/E3的同源重组取1μL(约100ng)纯化的骨架载体pAdenoVatorΔE1/E3和5μL(约1μg)经PmeⅠ线性化的转移质粒pA5-VP1在1个灭菌的离心管中混合;电转化入感受态大肠杆菌BJ5183中(电转化仪的参数设置为：2.5kV，25μF，200Ω)，使其在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。获得疑似重组腺病毒质粒用PacⅠ进行酶切鉴定，将阳性重组腺病