微管靶点药物combretastatin a-4及其衍生的抗肿瘤药效学及其机制研究

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1、浙江大学博士学位论文微管靶点药物CombretastatinA--4及其衍生的抗肿瘤药效学及其机制研究姓名：吴睿申请学位级别：博士专业：药理学指导教师：何俏军;杨波2012-06-05浙江大学博士学位论文中文摘要微管靶点药物CombretastatinA．4及其衍生物的抗肿瘤药效学及其机制研究中文摘要背景：微管广泛存在于真核细胞的胞质内，是由QB两种微管蛋白聚合而成的管状聚合物。作为构成细胞骨架的主要成分之一，微管在维持细胞形态，参与细胞的收缩和胞质内物质的运输等方面发挥着重要的作用。尤其是其在细胞分裂前期解聚重组形成纺锤体参与到细

2、胞有丝分裂中的这一特殊的生物学功能使之成为抗肿瘤药物的重要靶点。肿瘤细胞具有快速增殖的能力，若抑制其纺锤体的形成，必将影响细胞有丝分裂的正常进行，使得肿瘤细胞生长停滞于G2／M期。二十世纪初以微管为靶点的紫杉醇类药物在临床上的成功应用激起了人们寻找和改造新型微管类靶点药物的浓厚兴趣。尽管人们对紫杉醇不断地进行结构改造和修饰但其水溶性差，易产生多药耐药以及毒副作用强等问题还是限制了其临床上的广泛运用。寻找新型的微管靶点药物一直是抗肿瘤药物学领域研究的热点之一，直到1987年美国国家癌症研究所Pettit等从南非矮生柳树(Combret

3、嘲caf．fmm)中发现了天然活性产物combretastatinA一4(cA．4)。作为经典的微管聚合抑制剂秋水仙碱的类似物，cA．4还具有较强的破坏肿瘤血管的作用。因而与传统的微管类药物相比，cA．4具有抗癌效果强，不易产生耐药等诸多优点，而且由于其结构新颖，便于改造和修饰，颇受药物研究者的青睐。然而随着cA一4临床试验的深入，人们发现cA．4虽然能导致肿瘤细胞的大量坏死，但对残存的肿瘤组织的杀伤力较弱，因而常导致化疗的失败。本论文的研究旨在寻找一些新的CA．4的衍生物以及开发cA一4的临床应用潜能，探索常规的化疗药物或是临床一

4、线用药与cA．4合理的联合用药方案，以期通过以上两方面的研究达到减少用药量，增强药物疗效并减轻化疗药物的毒副作用的最佳治疗效果。同时对限制cA一4抗肿瘤疗TT浙江大学博士学位论文中文摘要效的分子机制做了进一步的研究，希望能为制定该类化合物临床治疗策略提供全新的思路。本论文将主要分为以下三个部分：(1)对经过结构改造和修饰得到的一系列CA．4衍生物进行抗肿瘤活性的筛选以及相应的药效学评价，并对从中得到的抗肿瘤活性较好，并且毒副作用较低的候选化合物进行初步分子机制的研究。(2)寻找合理的联合配伍用药方案，将不同作用机制的抗肿瘤药物与CA

5、一4合用，以期达到减少药物用量，提高疗效，减轻化疗药物的毒副作用的最佳效果。并进一步探讨两药合用的分子机制，力求为设计临床联合治疗方案提供新的方向。(3)为进一步推动cA．4的临床应用，解决其不能有效抑制化疗后残存的肿瘤细胞增殖的现象，我们对其抗肿瘤机制做了深入的研究，希望通过寻找限制cA．4抗肿瘤疗效的分子机制，采取相应的措施有针对性的进行克服。第一部分combretastatinA．4衍生物的抗肿瘤活性及其机制的研究目的：作为新型的微管聚合抑制剂，cA一4由于其结构简单，抗癌活性显著，因而备受药物化学家的关注。为进一步提高其疗效

6、，降低毒性，我们通过对一系列经过修饰的cA．4衍生物抗癌活性的筛选，旨在寻找具有广谱抗肿瘤活性的新型CA一4类化合物。方法和结果：xN05是一个新合成的combretastatinA．4的类似物。首先我们通过MTT法在六株不同组织来源的人肿瘤细胞上(sGc、Pc．3、EcA、McF．7、A2780和A549)对xN05的抗肿瘤活性进行细胞水平检测。结果显示其具有较强的抗肿瘤活性，Ic50值均小于2“M，而在两株肝癌细胞BEL．7402和sMMc一7721上的抗肿瘤活性比cA．4更强。值得注意的是，在正常的肝实质细胞HL一7702上x

7、N05的Ic50值要明显高于cA．4，提示我们该化合物对正常组织来源的细胞杀伤作用相对较弱。进一步通过离体的微管蛋白聚合实验和免疫荧光实验的结果证实III浙江大学博士学位论文中文摘要删05也是以微管为靶点发挥其抗肿瘤活性，并且列05抑制微管聚合的能力与其母体cA．4类似。引起细胞G2／M期阻滞是微管类药物的重要特征之一，运用流式细胞术在经过删05处理的两株肝癌细胞中均能观察到明显的G2／M期细胞周期阻滞现象，并且该现象存在浓度和时间依赖性。westemblot结果显示xN05引起的G2／M期阻滞现象也可能与细胞周期关键蛋白cdc2，

8、cDK7以及cyclinB1的表达发生异常有关。随着药物作用时间的延长我们发现处于G2／M期阻滞的细胞最终走向了细胞的凋亡，进一步地肿瘤细胞的生长受到了抑制。结论：本研究表明经过结构修饰的新型cA．4衍生物xN05具有明确的作用靶点，