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1、基于pJFH-1的HCV全基因组扩增方法的建立郭艳、兰林、何长龙、洪国祜、程玲、毛青（400038重庆，第三军医大学西南医院全军感染病研究所）[摘要]目的基于pJFH-1建立能稳定扩增HCV全基因组的长链PCR方法。方法以pJFH-1为测试模板，通过优化PCR扩增中各个重要环节，包括引物的选择、甘油和/或DMSO最适浓度的筛选、循环条件的摸索等，建立能稳定扩增HCV全基因组的长链PCR方案。结果高Tm值（＞65℃）的引物更有利于HCV全基因组的扩增；5%、10%甘油或5%DMSO可显著提高PCR扩增的特异性和扩增效率，且甘油的促进作用优于DMSO；双温法较三温法能获得更高产量的PCR产
2、物。结论通过优化长链PCR反应体系及条件，成功实现HCV基因全长的扩增。[关键词]长链PCR、pJFH-1、HCV全基因组Amplificationoffull-lengthhepatitisCvirusgenomebasedonpJFH-1GuoYan,LanLin,HeChanglong,HongGuohu,ChengLing,MaoQing(Departmentofinfectiousdiseases,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)[Abstract]Objective
3、Tooptimizetheprotocoloflong-PCRforamplifyingfull-lengthHCVgenomebasedonpJFH-1.MethodsOptimizationoflongPCRstrategiesbytestingaseriesofprimers,addingvariousconcentrationsofglycerol,DMSOorboth,usingdifferentcyclesystems,thenselectedtheoptimallongPCRconditions.ResultsPrimersthathavehighermeltingtem
4、peratures（＞65℃）couldimprovetheefficiencyofamplification.5%、10%glycerolor5%DMSOperformedtheoptimalconcentrationtopromotetheamplificationoffull-lengthHCVgenome.ThepromotingeffectofglycerolwasbetterthanDMSO.Comparedtothree-stagetemperaturemethod,two-steptemperaturecouldproducemorePCRproduct.Conclus
5、ionThroughtheoptimizationoflong-PCRprotocol,full-lengthHCVgenomewassuccessfullyachieved.[Keywords]long-PCR、pJFH-1、full-lengthHCVgenomeSupportedbyResearchonscreeningefficientreplicationstrainsofhepatitisCvirusandestablishingcellculturesystemsinvitro,ScientificResearchFoundationforReturnedScholars
6、,ThirdMilitaryMedicalUniversityofChina(2009XGH08).Correspondingauthor:MaoQing,Tel:86-23-68754475，Email:qingmao@yahoo.com丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus，HCV）感染是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要原因之一。建立HCV多基因（亚）型，尤其是我国最主要1b基因亚型的体内、外培养模型，是深入进行HCV生物学特性及抗病毒药物研究的重要基础。目前被大量采用的多片段扩增拼接HCV全长基因组的方法[1-4]已经证明是很难获得高复制特性的HCV病毒株（仅2a型毒株JF
7、H-1[5]除外），这是由于HCV存在复杂的准种特性，多片段拼接法易造成不同变异株间的错误连接，得到的只是人工重组体，而不是患者体内真实存在的病毒基因组。但HCV病毒RNA基因组长达9.6kb，并具有复杂的二级结构，从HCV患者血清中一次性直接扩增出全长HCV基因组的难度非常大。本研究首先以HCVpJFH-1质粒为模板，通过优化各种反应体系及条件，摸索出了适用于HCV全长扩增的长链PCR方案，现报导如下。1材料和方法1.1材料pJFH-1质粒由
