刺参(apostichopus japonicus)体腔细胞原代培养技术的建立及其在快速筛选免疫增强剂中的应用

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1、中国海洋大学博士学位论文刺参（Apostichopusjaponicus）体腔细胞原代培养技术的建立及其在快速筛选免疫增强剂中的应用姓名：许乐乐申请学位级别：博士专业：水生生物学指导教师：麦康森20090601中国海洋大学博士学位论文：刺参(Apostichopusjaponicus)体腔细胞原代培养技术的建立及其在快速筛选免疫增强剂中的应用剌参(Apostichopus．iaponicus)体腔细胞原代培养技术的建立及其在快速筛选免疫增强剂中的应用摘要本文以我国重要的海水养殖动物刺参(彳postichopusjaponicus)为研究对象，探索了刺参体腔细胞的体外原代培

2、养技术，并用细菌细胞壁的主要成分脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)对离体培养条件下的刺参体腔细胞进行刺激，通过检测细胞一系列免疫酶活性，和吞噬能力，呼吸爆发等免疫指标的变化，建立了刺参体腔细胞免疫能力的评价方法。然后使用潜在的免疫增强物质壳寡糖(chitooligosaccharide，COS)体外刺激体腔细胞，证明了壳寡糖对刺参体腔细胞具有免疫促进效果。养殖实验证明壳寡糖也能够在个体水平上有效地提高刺参的免疫能力，提示壳寡糖可作为一种新型的刺参免疫增强剂进行开发。同时证实了体内体外实验的结果有良好的一致性，为将来在体外高通量大规模地，j．筛选刺参免疫

3、增强剂打下了基础。主要研究结果如下：1．使用营养成分由低到高的三种培养液，CCM(成分为O．5MNaCl，5mMMgCh，1mMEGTA，20mlVlHEPES，葡萄糖0．6edl，l酊蛋白胨，50units／ml青霉素，50Itg／ml链霉素，pH7．6)，HSM【成分为31g／lNaCI，10mlVlHepes，10m酊酚红，10％(vol／v01)MinimumEssentialMedium(MEM)，1胡蛋白胨，50units／ml青霉素，50p鲈111链霉素，pH7．6】，L．15N(主要成分为Leibovitz’sL．15细胞培养液，补充加入23胡NaCI，青

4、链抗生素和硫酸庆大霉素50pg／ml，pH7．6)，对刺参的体腔细胞进行了体外培养，并使用MTT还原方法对细胞在体外的存活力进行了测定。结果显示，以CCM和HSM培养液培养的体腔细胞，在体外2日和5日后细胞活性明显下降。L一15N培养液则能够维持细胞活性，l周内保持稳定。重点观察并记录了刺参6类体腔细胞的两种主要免疫细胞，球状细胞和吞噬细胞的形态。刺参体腔液的渗透压等同于其生活的海水，然而其PH值略低于海水。发现刺参体腔液中存在着细菌。本实验结果可为以后开展其他棘皮动物的体腔细胞体外中国海洋大学博士学位论文：刺参(Apostichopusjaponicus)体腔细胞原代培

5、养技术的建立及其在快速筛选免疫增强剂中的应用培养工作提供技术指导，即1，弄清体腔液的各种理化因子和特性，2，满足体腔细胞的营养需求。2．使用脂多糖对体外原代培养的刺参体腔细胞进行免疫刺激。脂多糖刺激浓度为0，O．5，5，20IJg／ml，分别于刺激后1h，3h，6h，12h，18h，24h，48h取样，测定了细胞中3种免疫酶，酸性磷酸酶(ACP)，总一氧化氮合酶(T-NOS)，超氧化物歧化酶(T-SOD)，和吞噬指数，呼吸爆发的活性变化情况。实验结果显示，脂多糖的刺激，显著提高了细胞的吞噬指数，呼吸爆发和T-NOS，T-SOD两种酶的活性(P

6、性变化几乎没有影响。双因素方差分析显示海参体腔细胞的T-NOS和呼吸爆发同时受到脂多糖处理时间的影响，并且脂多糖刺激浓度和处理时间之间存在着显著的相互作用(P

7、，6h，12h，24h取样，测定了细胞中3种免疫酶，酸性磷酸酶(ACP)，总一氧化氮合酶(T-NoS)，超氧化物歧化酶(T-SoD)，和吞噬指数，呼吸爆发的活性变化情况。实验结果显示，壳寡糖的刺激，均在不同程度上显著提升了细胞的吞噬指数，呼吸爆发和T-NOS，T-SOD，ACP三种免疫酶的活性(P<0．05)。壳寡糖能够在体外显著提升刺参主要免疫细胞体腔细胞的免疫力，提示其可能可以作为一种新型的免疫增强剂，应用到刺参的实际养殖实验中去。4．研究了在饲料中添加壳寡糖对刺参生长和免疫状况的影响。壳寡糖的添加量分别为O(对照)，10