刺参(apostichopus japonicus)热休克蛋白基因克隆及其对温度、盐度胁迫的响应

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1、中国海洋大学硕士学位论文刺参（Apostichopusjaponicus）热休克蛋白基因克隆及其对温度、盐度胁迫的响应姓名：于姗姗申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：董云伟201206刺参(和Dst，动印惦却卯，c惦)热休克蛋白基因克隆及其对温度、盐度胁迫的响应摘要本文详细综述了OCLTT理论的研究进展，并通过实验研究了温度和盐度变化对热休克蛋白70、90表达的影响。研究结果总结如下：1．刺参(却嬲出厅叩珊j『印伽站搬)热休克蛋白70和90基因克隆及序列分析本研究以刺参么pDsffc办印甜5，印D胛比甜s为实验对象，利用同源克隆技术和RACE技术获得了热休克蛋白7

2、0(GellBalll(Accessionno：EU930813)和90(GeIlBankAccessionno：JF907619)基因，它们cDNA长度分别为2176和2293bp，开放阅读框长度为1950和2184bp，分别编码649和727个氨基酸的多肽分子。推导的氨基酸序列存在热休克蛋白70和90家族的签名序列，与已知其他物种的热休克蛋白70和90的氨基酸序列具有较高的同源性(热休克蛋白70，72—76％；热休克蛋白90，76—81％)。热休克蛋白70和90基因的克隆，对深入研究刺参对于环境胁迫的生理响应机制具有重要意义。2．盐度骤变对刺参(却嬲疵^印淞j『印彻记

3、淞)五印70及矗印90基因表达的影响为研究夏季暴雨导致的养殖池塘盐度变化对刺参(彳pDsffc办Dp螂．，印D玎fc珊)生理的影响，本研究在实验室内模拟野外盐度变化，采用半定量RT—PCR的方法研究了其办印70、办Jp90a及矗印90b基因表达。在本实验中，盐度先以每6h降2．5的速度由30降至20；保持96h后，再以同样的速度由20升至30，随后在盐度为30条件下保持96h。在盐度变化过程中随机取样。办印70和办印90b基因在盐度降至20后表达量开始显著升高(尸<0．05)，办印90a基因在盐度降至22．5时表达量开始显著升高(尸

4、3个基因的表达量均逐渐降低至初始值。在之后盐度升高及恢复阶段，3个基因表达量均有先升高后降低的趋势，表明姊70、办印90a和办印90b基因是刺参在盐度胁迫下的重要响应因子。3．变温模式下刺参耗氧率及厅印加、厅印如基因表达量的变化生物对温度变化的生理反应可以反映出生物个体对其生存环境的进化适应及其对热胁迫的耐受能力。为了研究潮间带生物对热胁迫的生理适应，本实验测定了刺参在热胁迫下的耗氧率及热休克蛋白基因表达量。模拟自然环境温度变化，研究刺参温度、生理反应(耗氧率和热休克蛋白)以及热耐受之间的关系。当温度由24℃升至30℃，刺参耗氧率下降、热休克蛋白基因(矗sps)表达量上升

5、。当水温超过30℃，刺参出现大规模死亡，表明上调表达的热休克蛋白以及死亡率都与有氧代谢的下降关系紧密，这一现象与氧气与能力限制的热耐受性理论(OCLTT)相一致。刺参的这种生理上的热耐受性反映了其对自身生存环境的一种适应能力。关键词：刺参；分子克隆；温度；盐度；耗氧率；热休克蛋白Heatshockproteingenecloningandresponsesofseacucumber坳傩鼬印淞却D刀站淞Selenl【a)totemperatureandsalini毋StreSSAbstract1．MoIecularcloningandsequenceanalysisof^j

6、p70and^置P90inseacucumberTotalRNAwaSextractedfromseacucumber(却Dsf纪办9p淞／印D船七“sSelenka)，Hsp70genewithGeIlBanknumberofEU9308l3andHsp90genewithGenBanknumberofJF907619wereobtainedbyusingRT—PCRandRACE。’111eseacucumberHsp70genecDNAsequencewas2176bpa11dt11elen舀hopenreadingfhmewaS1950bpthatencoding

7、a649amino—acidpolypeptide．TheseacucumberHsp90genecDNAsequencewas2293bpandthelengthopenreading矗撇ewas2184bpthatencodinga727锄ino—acidpolypeptide．Thededucedamino-acidpolypeptideofHsp70andHsp90possessedHsp70andHsp90proteinfI锄ilysigllaturerespectiVely，aJldhaVehi曲lyhomolog