达氏鳇热休克蛋白70和90基因的克隆及其对温盐胁迫的响应

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1、分类号密级UDC编号硕士学位论文达氏鳇热休克蛋白70和90基因的克隆及其对温盐胁迫的响应彭国干(1261003)指导教师姓名赵文教授专业名称生态学论文答辩日期2015年5月25日学位授予日期2015年6月THISFORTHEMASTERDEGREEOFSCIENCECloningHSP70andHSP90genesofHusodauricusandtheeffectsoftemperatureandsalinitystressontheirgeneexpressionSupervisor:Prof.WenZhaoMastercandidate:Guogan

2、PengINSTITUTEOFAQUACULTUREANDLIFEDALIANOCEANUNIVERSITYDALIANLIAONINGP.R.CHINAJune2015摘要摘要达氏鳇自然种群是生活于我国黑龙江及其流域的冷水性淡水鱼，属于鲟科鱼类，其个体大，抗病力强，性成熟晚，养殖目的主要是获取鱼子酱。目前，达氏鳇养殖群体已从寒冷的黑龙江南移至北京、河北、湖北、四川、重庆、云南等地，养殖温度逐渐升高，运输频率逐渐变大，达氏鳇面临着越来越严峻的生存考验。热休克蛋白（HSP）是生物体中重要的应激蛋白，它对保持机体内环境稳态方面有突出的作用。本文的主要目的是研究

3、热休克蛋白在帮助达氏鳇应对严峻环境挑战时做出的调控方式，以期为达氏鳇在养殖和运输方面提供理论支持，旨在为保护达氏鳇人工种群提供理论依据。本文采用同源克隆法和末端快速扩增（RACE）技术克隆了达氏鳇HSP70和HSP90基因全长序列，并设计5个温度梯度（4℃、10℃、16℃、25℃、28℃）和5个盐度梯度（0ppt、10ppt、20ppt、30ppt、40ppt）的条件对达氏鳇进行处理，以温度16℃盐度0ppt作为对照，做组织表达差异分析，同时取肌肉、鳃丝和肝脏作为样品做荧光定量分析。试验结果得出，达氏鳇HSP70基因（Genbank登录号：KP050541

4、）序列全长为2275bp，包括5′非编码区85个核苷酸，3′非编码区237个核苷酸和开放阅读框（ORF）1953个核苷酸。通过分析氨基酸序列发现，达氏鳇HSP70基因编码氨基酸650个，分子量71.13KD，理论等电点5.215，含有HSP70家族的3个标签序列，分别位于氨基酸序列的9－16（IDLGTTYS），197－210（IFDLGGGTFDVSIL）和334－348（IVLVGGSTRIPKIQK）上。达氏鳇HSP90基因（Genbank登录号：KP050542）序列全长2718bp，包括5′非编码区44bp，3′非编码区497bp和开放阅读框（O

5、RF）2178bp。通过分析氨基酸序列发现，达氏鳇HSP90编码725个氨基酸，分子量83.62KD，其理论等电点4.846。该蛋白含有HSP90家族的1个标签序列，位于氨基酸序列的32－41（YSNKEIFLRE）上。达氏鳇热休克蛋白组织表达分析显示，HSP70和HSP90在达氏鳇的11种组织中都有表达，包括肌肉、鳃丝、脑、须、心脏、肝脏、脾脏、胃、肠道、鰾和性腺，其中两个基因在肠道中的表达量均最高，在肌肉中的表达量均最低，同时我们发现HSP70和HSP90在各组织间的表达趋势是一致的。温度胁迫表达分析结果显示，4℃处理下在肌肉，鳃丝和肝脏中达氏鳇HSP

6、70和HSP90的表达量均是最高；相对于高温胁迫（25℃、28℃），达氏鳇HSP70和HSP90对低温胁迫（4℃、10℃）更敏感。盐度胁迫表达分析结果显示，各盐度胁迫下，达氏鳇HSP70和HSP90基因表达量变化不大。本研究结果分析表明，达氏鳇热休克蛋白在4℃情况下高表达，说明HSP70和HSP90基因在伴随达氏鳇度过严寒的环境发挥了非常重要的作用；高温胁迫下，达氏鳇HSP70和HSP90基因表达也高于对照组，说明热休克蛋白在达氏鳇处于高温环境下起到重要的作用。盐度胁迫下，热休克蛋白表达变化不明显，说明达氏鳇能够比较好地应对体内渗透压的变化，能够在调节机体

7、内环境动态平衡方面起到重要作用。在生产实践中，达氏鳇常遇到高低温胁迫，达氏鳇能否在养殖环境下健康生长这个疑问常常困扰着人们，本试验结果恰好能给这个问题带来很好的理论支持。传统水产养殖过程中，人们通常使用盐度30－50ppt摘要给鱼体消毒，并且在运输过程中使用一定盐度的水，本研究可以很好地证明在分子水平上达氏鳇能够适应这些水体盐度的变化。同时，本试验研究结果还可以为冷水性淡水鱼胁迫响应机制的研究提供数据参考，为保护达氏鳇的人工种群提供理论依据。关键词：达氏鳇，热休克蛋白70和热休克蛋白90，分子克隆，温盐胁迫，表达分析AbstractAbstractHuso

8、dauricusisacoldfreshwaterfishbelo