dmd病人特异性ipscs诱导及hescs向限定性内胚层细胞分化的研究

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1、万方数据UDC570硕士学位论文学校代码!堕三兰密级公珏DMD病人特异性iPSCs诱导及hESCs向限定性内胚层细胞分化的研究TheStudyOilDMDpatientspecificiPSCsinductionandhESCsdifferentiateintoDefinitiveendodermcells作者姓名：苏家荪学科专业：遗传学学院(系、所)：医学遗传学国家重点实验室导师：梁德生教授指导小组：刘雄吴副教授邬玲仟教授夏家辉院士答辩委员会主席中南大学二。一四年六月r、刁弋蕴丫八=赵万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下

2、进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：蓝选学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行

3、检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：盏：蓝盏日期：丝坚年』月上日导师签名皇三鍪至呈三卜万方数据硕士学位论文中文摘要DMD病人特异性iPSCs诱导及hESCs向限定性内胚层细胞分化的研究摘要胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)和诱导多潜能性干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)为基因修饰以及基因治疗提供了一种新型的研究工具。将基因修正后的人类多潜能性干细胞细胞经过自体移植，可实现某些遗传疾病治疗的目的。我室一直致力于杜氏肌营养不良(DⅧ)及血友

4、病A的基因治疗研究。作为基因治疗的靶细胞，解决iPS细胞的来源是进行后续研究得以顺利开展的基础。本研究第一章内容拟将病人来源的尿液细胞诱导为iPS细胞，为后续DMD病人的自体化基因治疗提供合适的细胞来源。第二章研究内容拟利用我室之前建立的定点整合hFⅧ的人胚胎干细胞细胞株ET5作为研究对象，初步建立hESCs向限定性内胚层细胞(Definitiveendodermcells，DECs)分化的技术平台，从而为后续血友病A的治疗中肝细胞的来源提供一种解决思路。第一章：DMD病人尿液细胞向iPSCs的诱导与初步鉴定。目的：利用DMD病人尿液来源的细胞获得病人特异性i

5、PSCs。方法：1．收集DMD基因50号外显子缺失的DMD病人尿液，分离并培养尿液细胞中肾小管上皮细胞。2．利用逆转录病毒将Oct4，Sox2，c．Myc和Klf4四种转录因子导入尿液细胞，经过20天左右的诱导，获得形态与hESCs细胞系高度相似的细胞克隆。3．对所得的细胞克隆进行多潜能性干细胞的表面标志物、碱性磷酸酶、细胞核型及体外随机分化的鉴定。Ⅱ万方数据硕士学位论文中文摘要结果：1．经上述方法诱导可获得尿液细胞来源的iPSCs样细胞系，MLPA检测诱导后iPSCs基因组DMD基因50号外显子缺失；2．诱导iPSCs细胞碱性磷酸酶染色阳性，且干细胞表面标志

6、物表达与hESCs一致；细胞染色体核型显示无染色体水平的畸变；体外EB形成检测诱导的iPSCs可分化出表达内、中胚层特异标志物的细胞。结论：建立了DMD基因50号外显子缺失的iPS细胞系。第二章：hESCs向限定性内胚层细胞的诱导分化。目的：初步建立hESCs定向限定性内胚层细胞诱导分化以及鉴定的技术平台。方法：1．联合BMP4、ActivinA、chir99021诱导ET5向限定性内胚层细胞分化；2．分化过程的第一天和第五天抽提分化细胞的RNA，RT-PCR检测内胚层标志基因Soxl7，FoxA2的表达情况；3．分化五天后流式分析DE细胞表面特异标志物c．1

7、dt(CDl17)、CXCR4(CDl84)的表达。结果：1．联合高浓度ActivinA、BMP4、chir99021对ET5诱导5天，分化第二天即可在ET5克隆中观察到上皮样细胞的出现。2．分别抽提分化过程当中第一天和第五天的细胞的RNA，RT-PCR分析可检测到Soxl7，FoxA2的表达。3．诱导五天后，流式分析DE细胞表面共表达c．kit、CXCR4阳性率达到39．01％。结论：初步建立hESCs向限定性内胚层细胞分化的方法。关键词：诱导多潜能干细胞，DMD，人胚胎干细胞，限定性内胚层细胞分类号：Q39III万方数据硕士学位论文英文摘要TheStudy

8、onDMDPatientSpecifi