DMD病人特异性iPS细胞系的诱导及其打靶的初步研究

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1、中图分类号Q三垒!UDC硕士学位论文学校代码!Q堇3刍密级公珏DMD病人特异性iPS细胞系的诱导及其打靶的初步研究PreliminaryStudyoftheInductionandTargetingofDMDPatient·-specificiPSCellLines作者姓名：刘博学科专业：遗传学研究方向：基因治疗学院(系、所)：医学遗传学国家重点实验室导师：梁德生教授指导小组：刘雄吴副教授’邬玲仟教授夏家辉院士论文答辩日期丝丛墨：丝答辩委员会主中南大学2013年5月原创性声明IIJllIfllIllIflIIIIJ

2、IY2423883本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，

3、可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名——导师签名——日期——年一月一日硕士学位论文中文摘要DMD病人特异性iPS细胞系的诱导及其打靶的初步研究摘要杜氏肌营养不良(DⅧ)是一种致死性X连锁隐性遗传病，该疾病是由于DMD基因的突变造成Dystrophin蛋白的缺失或功能丧失所致，目前临床上对该疾病尚无有效的治疗手段，而基因治疗的兴起为DMD治疗带来了新的希望。本研究首先以逆转录病毒诱导DMD患者皮

4、肤成纤维细胞(HDFs)成为DMD病人特异性ips细胞(DFiPS)，然后构建新型非病毒核糖体区基因打靶载体pHr2-nl-CDysG，并对上述ips细胞进行打靶的初步实验研究。为将Minidystrophin基因定点整合至iPS细胞基因组中，筛选稳定表达MJnidystrophin蛋白的iPS细胞克隆奠定了基础，也为采用CXvivo(间接体内)途径进行DMD基因治疗开辟一条新的思路。第一部分：DMD患者皮肤成纤维细胞诱导自体多潜能干细胞目的：利用皮肤成纤维细胞诱导建立DMD疾病特异型ips细胞系。方法：利用逆转录

5、病毒介导的转染系统将四种经典转录因子Oct4，Sox2，c—Myc和Klf4导入DMD患者皮肤成纤维细胞，并且在诱导过程中添加小分子Vc和VPA，最终获得DMD患者来源的iPS细胞。通过细胞形态学、碱性磷酸酶染色、干细胞表面多潜能标志物染色及细胞核型检测对传代后的克隆进行鉴定。结果：(1)将包装质粒和逆转录病毒载体通过脂质体硕士学位论文中文摘要Lipofectamine2000共同转染293T细胞后，获得优质逆转录病毒；(2)诱导出细胞克隆形态上与iPS细胞相似，挑取上述克隆传代，碱性磷酸酶染色呈阳性，iPS细胞表

6、面标志免疫荧光检测呈阳性。传至P9代，仍然具有iPS样克隆形态。(3)通过细胞染色体核型检测显示诱导后细胞没有发生染色体水平的突变。结论：利用逆转录病毒系统将DMD患者皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞，通过细胞核型、表面标志物及体外分化等鉴定DMD疾病特异型iPS细胞系的全能性。第二部分：新型DMD基因治疗载体的构建及打靶探究目的：构建携带Minidystrophin治疗基因的新型非病毒核糖体基因区打靶载体，通过打靶将Minidystrophin基因定点整合至DFiPS细胞基因组中，筛选稳定表达Minidystro

7、phin蛋白的DFiPS细胞克隆。方法：(1)pHr2．n1．COysG打靶载体的构建：首先用PCR克隆CAG启动子和BGHPolyA，然后将其正向连入pGEM．TEasy载体当中。从本室构建的核糖体基因区打靶载体pHrneoDysG中酶切下DysG融合基因，连入CAG启动子和BGHPolyA之间。再将CAG．DysG．BGH片段从pGEM．TEasy载体上切下，连入本室构建的新型核糖体基因区打靶载体pHr2．nl中，得到DMD基因治疗载体pHr2．n1．CDysG。(2)采用核转染的方法转染单细胞化的DFiPS细

8、胞，并在转染后加入Y27632提高细胞存活率。结果：(1)构建的载体pHr2一nl-CDysG经PmeI和AhdI酶切鉴TTT硕士学位论文中文摘要定，所获得的酶切片段大小与理论值相符。(2)载体pHr2一nl-CDysG的测序结果与理论序列相符。(3)将pHr2．n1．CDysG核转到DFiPS细胞中，可观察到一定数量iPS细胞eGFP基因的表达。结论：成功