姜黄素提高hescs向rpe定向诱导效率的相关研究

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1、万方数据分类号：R77密级：学位类别：科学学位团专业学位口。学校代码：1062学号：2011602592学科门类：医学又坪鼍科鼻辱硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：姜黄素提高hESCs向RPE定向诱导效率的相关研究TITLECurcuminPromotingDirectionalInductionEfficiencyfromHumanEmbryonicStemCellstoRPE一级学科：临床医学二级学科：眼科学论文作者：殷秋菊指导教师：李筱荣导师组成员：李筱荣教授杨春波Ph．D．天津医科大学研究生院二。一四年五月万方

2、数据学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：阻日期：沙nt年了月1上日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关

3、部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在——年解密后适用本授权书。本论文属于不保密圈。(请在相对应的方框内打“√”)学位论文作者导师签‘矽叶年S月2，2日知竹年f月晓日万方数据天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：本实验主要研究姜黄素(Curcumin)对人胚胎干细胞(Humanembryonicstemcells，hESCs)向视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium，RPE)定向分化的影响。并初步探姜黄素在体外诱导人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞分化过程中对Wnt／13．catenin信号通路的影响，为进一

4、步提高hESC向RPE定向诱导效率和推动视网膜变性疾病细胞治疗的临床转化提供理论依据。方法：(1)hESCs购于美国Stemcell公司。体外培养hESCs，在hESCs自主分化14天的基础上以Curcumin处理细胞，具体分组如下：@Curcumin剂量梯度实验：实验设置6个Curcumin作用剂量，终浓度分别为：09mol／L(对照)、1p．mol／L、29mol／L、5pmol／L、109mol／L和209mol／L。Curcumin处理24h后更换为正常诱导分化培养基。观察各组细胞色素化情况。收集分化第22天和第36天细胞，采取荧光定量R

5、T-PCR检测各组细胞干细胞标志基因及RPE标志基因的表达水平。选取RPE标志基因表达水平最高的Curcumin浓度进行后续试验。②Curcumin时间梯度实验：根据上述实验结果选取19mol／L的Curcumin作用浓度，实验设置5个作用时间，分别为：0h组(对照)、24h组、3天组、1w组和2W组。Curcumin处理时间到后更换为正常诱导分化培养基。观察各组细胞色素化情况。收集分化第22天和第36天细胞，采用荧光定量RT-PCR检测各组细胞干细胞标志基因及RPE标志基因的表达水平。(2)人RPE(M冲E)分离培养与鉴定：因眼外伤而摘除的健康

6、青年人眼球，于手术后立即分离出视网膜，经胰酶消化后轻轻刮取RPE细胞层，收集细胞悬液离心沉淀后以lxl08个／L的密度接种于25cm2培养瓶，在37℃，饱和湿度及5％C02条件下培养。每2d用含10％胎牛血清的DMEM培养液半量换液1次，当细胞生长至90％融合状态时传代。采用Western．blot检测hRPE中CRALBP、RPE65和MITF蛋白的表达；采用与聚苯乙烯荧光微球共孵育12h检测hRPE细胞的吞噬功能。万方数据天津医科大学硕士学位论文(3)诱导来源的RPE(iRPE)的纯化与鉴定：利用RPE细胞的色素化外观，机械分离明显色素化的细

7、胞，进行传代培养并反复提纯，得到较纯的iRPE。采用Westemblot法检测iRPE细胞RPE65、MITF及CRALBP蛋白的表达；采用免疫荧光检测iRPE细胞Zo．1、MITF和PAX6蛋白的表达；采用与聚苯乙烯荧光微球与iRPE共培养检测iRPE细胞吞噬功能。(4)Curcumin处理hESCs向RPE定向分化过程中对Wnt／13．catenin信号通路的影响：采用荧光定量RT-PCR技术检测对照组与实验组WnUlB．catenin信号通路下游靶基因Lefl、TCF7、MYCmRNA的表达水平。结果：(1)Curcumin剂量梯度实验：经

8、Curcumin处理能明显促进hESCs向RPE定向分化。其中，CurcuminlgM和29M组细胞色素化程度最高。59M组产生的色素化