表达重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的大肠杆菌工程菌的高密度培养

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1、维普资讯http://www.cqvip.com中国生物工程杂志ChinaBiotechnology，2006，26(9)：11～15表达重组葡激酶一水蛭素融合蛋白的大肠杆菌工程茵的高密度培养钟根深石炳兴王海东蒋中华吴祖泽h(1军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京1008502北京海泰联合医药发展有限公司北京102600)摘要采用溶氧反馈的分批培养流加补料的方法高密度培养重组大肠杆茵BL21(DE3)生产重组葡激酶．水蛭素融合蛋白。通过摇瓶培养对菌种和培养务件的初步筛选，采用溶氧反馈的流加补料策略，进行了5L发酵罐的合成培养基和复合培养基的发酵工艺研究。通过对培养条件的不断优化，重组葡激酶．

2、水蛭素融合蛋白在大肠杆茵BL21(DE3)里得到了高效表达，茵体密度最终达到115g／L(WCW)以上，可溶性重组融合蛋白占茵体总蛋白的30％以上，含量约为1．1～1．2g／L。5L发酵罐的发酵工艺参数在40L发酵罐中进行了放大培养，结果表明该工艺能有效地放大，可适用于工业生产。关键词重组大肠杆茵葡激酶水蛭素高密度培养中图分类号Q786葡激酶(SAK)是由某些金黄色葡萄球菌分泌的一生产的载体，为满足商业生产中对产品的大量需求，工种非酶类蛋白，本身没有酶活性，当它与纤溶酶原1：1程菌的高密度培养来提高单位目的蛋白的产率也就成结合后能激活纤溶酶原，使之成为有活性的纤溶酶，产了一个必不可少的尝试。对

3、工程菌高密度发酵的研究生的级联反应能激活更多的纤溶酶原，发挥溶栓作用。可以提高单位蛋白产率从而减少发酵体积、简化上下凝血酶在整个凝血系统中起着一个中心的作用，而水游的工艺流程、减少废水的排放量、降低成本和减少对蛭素(HV)是凝血酶的特异性抑制剂，是一种新型的溶现有设备的再投入。从工业生产的角度来说，特别是栓和抗凝药物，但它在体内的半衰期短，且有一定的出对这种血栓类蛋白多肽药物来说，临床用药量很大，若血倾向。溶栓和抗凝药物的联合治疗是当前临床治疗用重组大肠杆菌作为蛋白生产的载体，能否对工程菌血栓相关性疾病的重要给药方案，重组融合蛋白的生产工艺的开发也就成为一个必须解决的问题。SFH⋯是SAK和H

4、V通过一个xa因子连接起来的蛋经过几十年的发展，人们已经认识了大肠杆菌高密白多肽，分子量约为23kDa，它以大肠杆菌作为生产的度培养的一些影响产率的关键因素，如菌种、pH、培养温载体。通过体内和体外药效学试验证明，融合蛋白度、培养时间、溶氧、比生长速率、流加方式、乙酸浓度、诱导时间等，这些在国内外都有综述。具体而言，由于SFH有着很好的溶栓和抗凝双功能，出血倾向降低，且表达的蛋白不一样，所以相应的培养条件就不一样，结果具有一定的血栓靶向性，较SAK和HV联合用药有着也就不一样。但作为大肠杆菌这种宿主菌，也有其共性，更好的效果，因而有着广泛的应用前景。如发酵过程中的pH、培养基、培养温度、诱导温

5、度、接种大肠杆菌由于易于培养，生长速度快，遗传学资料量、菌龄等，这些影响因素我们借鉴别人的成果，可以避丰富以及易于进行基因工程操作等特点，对工业规模免很多重复的劳动。我们结合前人的成果，经初步的培放大来说也相对容易实现，近几十年来作为重组蛋白养条件的优化，采用溶氧反馈的的流加补料策略，尝试了的表达系统而被广泛使用。若用其作为一个药用蛋白复合培养基和基于R-培养基的合成培养基的5L发酵收稿日期：2006-03-31修回日期：2006-04-28罐的小试，最后选择了复合培养基的高密度培养生产工}通讯作者，电子信箱：wuet@nie．bmi．ac．cn艺，成功地在高密度的情况下高效表达了具有生物活性

6、维普资讯http://www.cqvip.com12中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo1．26No．92006的重组葡激酶．水蛭素融合蛋白，并进行了三批40L的中溶氧反馈来决定，采用速率逐步增大的方式流加，并在试放大，证明了工艺的可行性和可放大性。升温诱导后进一步增大流加速率来提高比生长速率，以促使蛋白的大量表达；根据发酵溶氧下降的情况，逐1材料和方法步手动调节转速至最大800r／min后，才开始增大通气1．1材料量至最大，并在后面的发酵过程中保持通气和转速在1．1．1菌株带有温度诱导型pBV220-SFH表达载体最大值；通过流加补料的速率来控制溶氧大于30％。的工程菌E

7、．coliDH5o【、BI2,1(DE3)、TG1为本室构建在培养不同的时间后开始升温至42~C诱导，诱导4．0h并保存。后下罐。1．1．2培养基摇瓶培养基(g／L)：蛋白胨10、酵母提1．4检测和分析方法取物5、NaCI10；发酵培养基(g／L)：(1)基于R-培养基(1)菌体浓度测定：发酵液取样在分光光度计上测的合成培养基：参考文献[5]；(2)复合培养基：定OD60o；同时取样4ml，100