人脐带间充质干细胞移植对实验性大鼠脑出血作用研究

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1、河北医科大学硕士学位论文人脐带间充质干细胞移植对实验性大鼠脑出血作用研究姓名：王广杰申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：赵宗茂201203中文摘要人脐带问充质千细胞移植对实验性大鼠脑出血作用研究摘要目的：将人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUMSCs)移植到大鼠脑出血模型，观察移植细胞在大鼠出血损伤脑组织中的存活、迁徙和神经分化情况，探讨hUMSCs移植对大鼠脑出血后神经功能恢复的影响及其作用机制，为hUMSCs在神经科学领域的临床应用提供理论依据及

2、实验基础。方法：无菌条件下收集足月妊娠剖宫产新生儿脐带，D．Hank’S洗去血管内的残存血，剔除脐带动静脉，将剩余的组织剪碎至1mm3大小的组织块，O．2％胶原酶II消化，在含有20％胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)、2ng／ml表皮细胞生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)、25mM左旋谷氨酰胺(L．glutamine，L．Glu)、100U／ml青霉素，100p．g／ml链霉素的DMEM／F12培养基进行原代培养。观察原代培养细胞的形态学变化，当细胞达到融合状态时，加入0

3、．25％胰酶．1mMEDTA消化细胞，并传代。收集消化后的细胞，以流式细胞法行细胞表型检测，包括PE．CDllb，PE．CD45，PE—CD73，PE—CD90，PE-CD105，PE-HLA—DR(HLA-II)，FITC．CDl9，和FITC．CD34并以FITC或PE标记的小鼠IgGl作为同型对照。选取体重在270-300g之间的成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，根据包新民《大鼠脑立体定位图谱》定位，用直径lmm的牙科钻头在大鼠右侧颅骨(AP一0．5mm；ML=3．0mm)钻孔，将微量注射器固定在

4、立体定向架上，取胶原酶VII水溶液2u1，以前囟为参照点缓慢注射到右侧尾状核头部(AP一0．5mm；ML=3．0mm；DV=5．5mm)，建立大鼠脑出血模型(intracerebralhemorrhage，ICH)。脑出血模型建立成功后24h，采用改良神经功能缺失评分(modifiedneurologicalseverityscore，mNSS)对实验动物进行神经行为学评价，选取评分在7．12分间(中度损伤)大鼠纳入实验，随机分为三组：(1)hUMSCs移植组，n=20；(2)磷酸盐缓冲液(PhosphateBuffe

5、redSaline，PBS)对照组，n=20；(3)假手术组(sham组)，n=5。将大鼠再次麻醉，头部固定于立体定向架上。用10“L的Hamilton中文摘要注射器，将1，1'．双十八烷．3，3，3’，3．四甲基吲哚羰花青．高氯酸盐(1，l'-dioctadecy!一3，3，3’，3’tetramethylindocarbocyanineperchlorate，DiI)标记的hUMSCs缓慢注射到hUMSCs组大鼠的右侧出血灶区域边缘(AP一0．5mmML=3．0mmDV=3．5mm)。每只大鼠接受10此注射，共2×

6、105细胞。拔针后用医用生物蛋白胶将注射针孔及骨孔封闭。PBS对照组依同样方法注入等量的PBS替代hUMSCs。细胞移植后1、7、14、21、28、35d对所有大鼠进行mNSS评分；将大鼠处死迅速断头取出全脑连续冰冻切片，免疫荧光染色检测DiI标记hUMSCs在出血脑组织中存活、迁徙以及成熟神经元标志．微管相关蛋白2(microtubule．associatedprotein2，MAP2)、神经胶质细胞标志．胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)的表达情况。采用SPSS1

7、5．0forWindows统计学软件对实验数据进行统计分析。结果：细胞培养第2d即可见有少量形态各异的贴壁细胞，散在分布。1W左右时，贴壁细胞形成集落，以后见成纤维细胞样克隆形成，克隆呈放射状生长。在培养2W，细胞接近90％汇合时，经消化后按1：2的比例将细胞传代。传代后数小时内可见其迅速贴壁，lW左右达到90％"-一95％汇合程度，低倍镜下细胞呈排列紧密的漩涡样结构。流式细胞检测显示这些细胞均一地高表达MSCs标志CD73、CD90、CDl05。不表达造血系标志CD34、CD45，中性粒细胞标志CDllb，人B细胞标

8、志CDl9。对组织相容性免疫表型的分析显示hUMSCs不表达人白细胞抗原HLA-DR(HLA．II)。细胞移植后24h，h切ⅥSCs移植组、PBS对照组大鼠的mNSS评分之间没有显著性差异(P>O．05)，但与假手术组比较，均存在显著性差异(P<0．05)。细胞移植后7～35d，hUMSCs组和PBS对照组动物的mNSS评分均有不