人脐带间充质干细胞协同脂肪颗粒移植的实验研究

《人脐带间充质干细胞协同脂肪颗粒移植的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、河北医科大学硕士学位论文人脐带间充质干细胞协同脂肪颗粒移植的实验研究姓名：刘超申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：杨建民201203中文摘要人脐带间充质干细胞协同脂肪颗粒移植的实验研究摘要目的：本研究在体外特定条件下，诱导人脐带间充质干细胞(humanumhilicalcordmesenchymalstemcells，hUC．MSCs)向脂肪细胞定向分化，并将诱导后具有脂肪细胞表型的hUC．MSCs混合脂肪颗粒移植于裸鼠腹部筋膜下，研究其在脂肪移植中促进血管再生及向脂肪细胞分化能力，为人脐带间充质干

2、细胞在脂肪移植中的应用奠定理论基础。方法：无菌条件下取得足月妊娠分娩新生儿脐带，用剪刀剪切成约4cm的脐带组织段，将其用无菌生理盐水冲洗干净以去除脐带中残留的血液。齿镊祛除一条脐静脉和两条脐动脉，避免血管内皮细胞污染组织，将脐带中华通胶组织(Wharton’SJelly)撕裂成条索状，将其剪成大小约lmm3的组织块，将华通胶组织块置于培养瓶中培养，得到hUC．MSCs，应用流式细胞术测定其表面抗原表达情况；合用浓度为1．0x10"6mol／L地塞米松、0．5mmol／L1．甲基．3．异丁基黄嘌呤、lOm

3、g／L胰岛素、0．2mmol／L吲哚美辛这四种成脂诱导剂定向诱导hUC．MSCs向脂肪细胞分化，观察细胞分化情况并利用油红．O免疫组化染色鉴定细胞的分化情况；取成年雄性SD大鼠肠系膜及腹股沟处脂肪，制备成体积约为O．5～lmm3的脂肪颗粒，免疫组织化学染色及扫描电镜观察切取的脂肪组织与剪碎离心的脂肪颗粒其细胞形态结构、组织中血管形态及大血管含量；雄性裸鼠30只，随机分为7天、14天、28天三组，采用同体对照的方法，左侧为实验侧，右侧为对照侧，将3组又分为7天实验组、7天对照组、14天实验组、14天对照组

4、、28天实验组、28天对照组；用终浓度为lOI．tmol／L的BrdU标定的hUC．MSCs向脂肪细胞诱导后，将具有脂肪细胞表型的hUC．MSCs混合脂肪颗粒注射移植至裸鼠左侧腹部筋膜下，相同剂量的单纯脂肪颗粒注射至裸鼠右侧腹部筋膜下；移植后7天、14天、28天时取出移植的脂肪组织称重，分析同一时期实验组与对照组两组之间脂肪重量差别；组织学观察：将取出的脂肪组织进行组织切片HE染色，对移植的脂肪组织结构、细胞形态及微血管含量进行观察；免疫组化染色：利用内皮细胞特异性标记CD34抗体．免疫组化法显示微血管

5、，将不同时期脂肪移植体按照周边中文摘要区及中央区划分，对各组微血管含量进行定量研究。实验组中利用BrdU抗体，检测经BrdU抗原标记的具有脂肪细胞表型的干细胞是否存在，已确定移植的干细胞是否成活，并向脂肪细胞分化。结果：1实验室前期鉴定结果证实：流式细胞技术检测细胞阳性表达干细胞表面标记CD29、CD44、CDl05，而造血干细胞表面标记CDl4、CD34、CD45表达呈阴性，证明培养获得的细胞为纯化的间充质干细胞。2联合应用地塞米松、1．甲基．3．异丁基黄嘌呤、胰岛素和吲哚美辛时诱导hUC．MSCs生

6、成脂肪细胞的转化率高达90％以上，油红．O染色阳性，证明干细胞向脂肪细胞分化。3hUC．MSCs对颗粒脂肪组织移植后重量变化的影响：移植400mg颗粒脂肪组织于裸鼠腹部筋膜下，移植7天、14天、28天后实验组移植物平均重量分别为(399．22土5．43)mg、(380．79士7．30)mg、(362．53士9．48)mg，重量维持率分别为99．8％、95．19％、90．63％。在同样观察时间内，对照组平均重量分别为(277．05+6．33)mg、(230．55+9．28)mg、(202．37+7．73)

7、mg，重量维持率分别为69．29％、57．64％、50．59％。统计结果显示，在相同观察时间内，实验组和对照组比较差异有显著性意义(P<0．01)。4移植物微血管观察：分别于各时期周边区和中央区取4个高倍视野，计数出每个视野微血管量。染成棕色单个内皮细胞、内皮细胞簇均视为1个血管计数单位，计算每平方毫米面积内微血管含量，求其均值。中央区血管密度在7天，14天，28天时，实验组分别为29．444-3．86个，45．744-5．07个，60．794-7．36个，对照组分别为16．834-3．13个，32．0

8、14-5．23个，44．04士6．10个。周围区血管密度在7天，14天，28天时实验组分别为65．104-4．18个，89．554-6．37个，73．304-6．33个，对照组分别为47．324-5．63个，71．474-5．51个，53．424-5．96个。利用SPSSl3．0统计软件进行统计分析。同一时期实验组与对照组中央区血管密度的比较，7天组(P