人脐带间充质干细胞移植对大鼠闭合性颅脑损伤的作用研究

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1、河北医科大学硕士学位论文人脐带间充质干细胞移植对大鼠闭合性颅脑损伤的作用研究姓名：冯钰珉申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：赵宗茂201203中文摘要人脐带间充质千细胞移植对大鼠闭合性颅脑损伤的作用研究摘要目的：建立大鼠颅脑损伤(traumaticbraininjury,TBI)模型，观察人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC．MSCs)在损伤脑组织中存活、迁移和分化情况，以及对损伤神经功能恢复的影响；初步探讨hUC。MSCs治疗颅脑损伤的作用机制，为其在颅脑损伤治疗的应用提供

2、理论依据。方法：取足月妊娠剖宫产健康新生儿的脐带，D．Hank’S液充分洗去残留血液，剔除脐动脉和脐静脉，将剩余的脐带间质组织剪成约1mm3大小的组织块，用O．2％胶原酶II消化后放入含有20％胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)、100U／ml青霉素，100}lg／ml链霉素的DMEM／F12中培养。观察原代培养细胞的形态学变化，当细胞达到80％～90％汇合时，进行消化并传代培养。收集消化后的细胞，流式细胞术检测CD45．PE、CD90．PE、CDl05一PE、CD73(SH3)．PE、CDllb—PE和CD34一FITC、CD

3、l9一FITC，甩A．DR(nA—II)．FITC，并以小鼠IgGl—PE和小鼠IgGl—FITC作为同型对照。选健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重2709-3209，采用液压冲击法制备颅脑损伤模型，24h后，依照改良神经功能评分(modifiedNeurologicalSeverityScore，mNSS)标准进行神经功能评分(Table1)，将7～12分(中度损伤)的50只大鼠纳入试验并随机分为三组：(1)hUC．MSCs组：20只，评分结束后将1，1’．双十八烷．3，3，3’，3’，四甲基吲哚羰花青．高氯酸盐(1，1

4、’一dioctadecyl一3，3，3’，3'-tetramethylindocarbocyanineperchlorate，DiI)标记的第5代hUC．MSCs移植到颅脑损伤部位，取两点，每点51al，总细胞数为lxl06个；(2)磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，PBS)组：20只，颅脑损伤部位以PBS替代hCU．MSCs注射，亦取两点，每点5u1；(3)单纯颅脑损伤组：10只，仅行颅脑损伤，损伤部位既不移植hUC．MSCs，亦不注射PBS。另随机选lO只大鼠为(4)假手术组：只开骨窗，不行颅脑损伤，亦不注射hUC

5、．MSCs或PBS。中文摘要大鼠于hUC．MSCs移植／PBS注射后第1、7、14、2l、28d采用mNSS进行神经功能评分，观察大鼠神经功能改善和恢复情况。评分结束后处死大鼠，取脑组织行连续冰冻切片，厚5岬。免疫荧光方法检测hUC．MSCs在脑组织内存活、迁移、分化情况，以及胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase，NSE)、微管相关蛋白2(microtubule．associatedprotein2，MAP。2)、八因子相关抗原(f

6、actorVIIIrelatedantigen，Ⅶ．RAg)、神经微丝(neurofilament，NF)、巢蛋白(Nestin)的表达情况。结果：原代细胞培养24h后观察到有少量细胞贴壁，8～10d后细胞大部分贴壁。2W时，细胞汇合达到80％"--90％，消化后按1：2或l：3的比例传代。细胞传代后生长迅速，形态均一，5~6d可传一代。流式细胞术检测结果显示：hUC．MSCs表达间充质干细胞表面抗原CD73、CD90、CDl05，不表达造血前体细胞表面抗原CD34、B型淋巴细胞表面抗原CDl9、中性粒细胞表面抗原CDllb、白细胞表面抗原CD4

7、5和甩A．DR，从而证实该细胞是MSCs。移植前采用噻唑蓝[3．(4，5)．dimethylthiahiaz01．2．y1．2，5．diphenytetrazoliumbromide，MTT]法检测hUC．MSCs细胞活力，细胞存活率达95％以上。移植hUC．MSCs移植后28d内，hUC．MSCs组死亡1只，死亡率4．8％；PBS组死亡lO只，死亡率33．3％；单纯颅脑损伤组死亡6只，死亡率37．5％。hUC．MSCs组的死亡率低于PBS组和单纯颅脑损伤组，差异有统计学意义(P

8、hUC．MSCs组未发现明显腹胀的大鼠。hUC．MSCs组和PBS组比较，差异无统计学意义(P>0．05)；hUC．MSCs组和单纯颅脑