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安徽医科大学硕士学位论文硕士学位论文人脐带间充质干细胞移植对肺气肿大鼠模型的影响EffectofHumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsonratmodelofemphysema作者姓名程雪松指导教师汪伟民副教授学科、专业老年医学研究方向慢性阻塞性肺疾病发病机制论文工作时间2010年3月至2011年12月2012年5月 安徽医科大学硕士学位论文论文原创性声明和授权使用声明学位论文独创性声明本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一起工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。学位论文作者签名:日期：学位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复印并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名:导师签名:日期:日期: 安徽医科大学硕士学位论文目录英文缩写一览表......................................................3中文摘要............................................................5英文摘要............................................................7正文..............................................................91前言..........................................................102实验材料........................................................102.1实验动物.................................................122.2主要设备和仪器...........................................122.3主要试剂.................................................133实验方法........................................................143.1实验分组.................................................143.2动物饲养.................................................153.3动物造模和干预步骤.......................................143.4人脐带间充质干细胞的分离、培养、保存及鉴定...............153.5人脐带间充质干细胞表面分子的检测.........................173.6Brdu标记细胞.............................................183.7细胞免疫荧光.............................................183.8HE染色...................................................193.9肺泡形态计量学观察.......................................203.10冰冻切片免疫荧染色.......................................213.10统计分析方法.............................................214结果...........................................................214.1hUCMSCs的培养及标记......................................214.2细胞表面分子检测.........................................224.3大鼠肺组织病理学........................................234.4免疫荧光检测移植的hUCMSCs在大鼠肺组织中的定植情况并计数255讨论...........................................................261 安徽医科大学硕士学位论文6结论...........................................................297研究不足与展望..................................................308参考文献........................................................30个人简介...........................................................36致谢...............................................................37综述...............................................................38参考文献...........................................................432 安徽医科大学硕士学位论文中英文缩略词表chronicobstructivepulmonaryCOPD慢性阻塞性肺疾病diseaseMSCsMesenchymalstemcells间充质干细胞humanUmbilicalCordhUCMSCs人脐带间充质干细胞MesenchymalStemCellsumbilicalcordblood-derivedUCB-MSCs脐带来源间充质干细胞mesenchymalstemcellsHLAIHumanleukocyteantigenI人类组织相容性抗原IHLAIIHumanleukocyteantigenII人类组织相容性抗原IITNFαtumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子αMacrophageInflammatoryMIP-1β巨噬细胞炎性蛋白1βProtein-1βIL-1βinterleukin-1β白细胞介素1βIL-10interleukin-10白细胞介素10PBSphosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液ddH2OdoubledistilledH2O双蒸水α-MEMalphaminimalessentialmediumα-最低必需培养基FBSfetalbovineserum胎牛血清DMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜Brdu5-Bromo-2-deoxyUridine5-溴脱氧尿嘧啶核苷DAPI4',6-diamidino-2-phenylindole4',6-二脒基-2-苯基吲哚3 安徽医科大学硕士学位论文H&Ehematoxylinandeosin苏木素和伊红DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸趋化因子基质细胞衍生SDF-1stromalcell-derivedfactor1因子1PDGFplatelet-derivedgrowthfactor血小板衍生生长因子mlmilliliter毫升dday天hhour小时minminute分钟μmmicron微米rpmRotationperminute每分钟转速kgkilogram千克ggram克4 安徽医科大学硕士学位论文人脐带间充质干细胞移植对肺气肿大鼠模型的影响中文摘要目的：1.从人脐带组织中分离间充质干细胞，体外培养、扩增和标记；2.利用猪胰蛋白酶一次性气管内滴入SD大鼠复制肺气肿模型；3.此模型基础上通过尾静脉注入Brdu标记的人脐带间充质干细胞，了解标记的细胞在在大鼠肺脏及其他重要脏器的定植情况；4.评价人脐带间充质干细胞对肺气肿大鼠的肺组织损伤的修复效果及其潜在的机制的探讨。方法：1.分离、培养、扩增、鉴定、标记人脐带间充质干细胞；2.建立用猪胰蛋白酶（porcinepancreaticelastase，PPE）气管滴注法复制的大鼠肺气肿模型。将体重170－220克的40只雄性健康SD大鼠适应性饲养一周后，然后随机分为4组：hUCMSCs+模型组(A)、PBS+模型组(B)、模型组(C)、假手术组(N)，每组各10只。采用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，A组、B组及C组分别向大鼠气管内滴入1U/gPPE，N组滴注等比量生理盐水，饲养76天后，hUCMSCs+模型组(A）予以用Brdu标记的hUCMSCs尾静脉注射；PBS+模型组干预组(B)予以PBS尾静脉注射；模型组(C)及假手术组(N)不予任何干预处理，各组继续饲养至14天后处死所有大鼠。取肺组织，固定、包埋、切片，行HE染色，观察各组大鼠的肺脏的病理变化及行病理形态学图像分析。结果：1.从人脐带中可分离出hUCMSCs，其阳性表达CD44和CD29，而造血细胞及内皮细胞标志物CD34,CD45均阴性表达，符合MSCs的细胞表型；2.与假手术组相比，模型组组大鼠肺泡结构紊乱，肺泡腔不规则扩大，肺泡壁变5 安徽医科大学硕士学位论文薄，并有不同程度的断裂；形态定量分析显示：平均肺泡数(NA)显著减少，平均肺泡面积（MAA）、平均内衬间隔（MLI）显著增大（P<0.05）；3.第1d、14d两个时间点肺组织内均可见到绿色荧光表达，每个视野下Brdu阳性细胞数分别为（21.14±7.9）、（3.02±1.85）；但是同时间点检测心、肝、脾、肾等组织均未见到或罕见到绿色荧光表达；4.大鼠肺组织病理学4组大鼠肺组织切片的HE染色显示：除N组以外，A组、B组、C组的大鼠的肺组织均出肺泡腔不规则扩大，肺泡壁变薄，并有不同程度的断裂。但A组较B组、C组肺气肿改变明显减轻。肺泡形态学结果显示:A组、B组、C组与N组比较，NA减少，MAA增大，MLI增大，差异均有显著性(P<0.05或P<0.01)；同时A组与B组、C组比较：NA增多，MAA减小，MLI减小，差异有显著性(P<0.05)；但B组与C组之间，NA、MAA及MLI均无明显差别，差异无显著性（P>0.05)。结论：1.本实验体外可成功分离纯化并扩增hUCMSCs，传代后仍能保持其原有的形态学特点；2.成功以1U/g猪胰蛋白酶气管内滴入制造出大鼠肺气肿模型；3.人脐带间充质干细胞在受损的脏器肺分布比例占优势，说明干细胞向受损脏器聚集的特性；未见明显免疫排斥现象，说明脐带来源的间充质干细胞免疫原性极低，可作为将来临床应用间充质干细胞的重要来源；4.hUCMSCs植入大鼠肺气肿模型，对于肺气肿的进展可发挥一定的干预作用。关键词：肺气肿；人脐带间充质干细胞；移植；定植；6 安徽医科大学硕士学位论文EffectofHumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsonratmodelofemphysemaAbstractObjective:1.Toexploredtheisolationofmesenchymalstemcellsfromhumanumbilicalcordandcultured,expansionandlabledinvitro.2.EstablishedtheemphysemamodelinSDratbyintratrachealinstillationofporcinepancreaticelastase(PPE).3.hUCMSCsweredeliveredtoemphysemaratthroughcaudalvein,meanwhileexploredthedistributionofBrdulabledhUCMSCsinlungandotherorgansofrat.4.ToevaluatetheeffectofhUCMSCsonlungtissuerecoveryinaratmodelandexploreitspotentialmechanism.Methods:1.hUCMSCswereisolation,cultured,expansionandlabeled.2.FortymaleadultSDratswereequallyandrandomlydividedinto4groups:emphysema+hUCMSCs-treatedgroup,emphysema+PBS-treatedgroup,emphysemagroupandsham-operatedgroup(n=10).Theemphysemaratmodelwasestablishedinallratwiththeexceptionofthesham-operatedgroupratsbyintratrachealinstillationofporcinepancreaticelastase(PPE).emphysema+hUCMSCs-treatedgroup(10rats)6wastreatedwith1×10hUCMSCsculturedin1.0mlphosphate-bufferedsaline(PBS)bycaudalvein,emphysema+PBS-treatedgroup(10rats)wastreatedwith1.0mlphosphate-bufferedsaline(PBS)bycaudalvein,emphysemagroup(10rats)andsham-operatedgroup(10rats)wereuntreated.hUCMSCsweredeliveredthroughcaudalveinofratsat76dayspost-induction.Allratsweresacrificedatday14post-treatment.Atthesametimeoutofthelungtissue,fixed,embedded,sectioned,7 安徽医科大学硕士学位论文stainedwithhematoxylinandeosinstaining(HE).Ratslungpathologicalsectionwereobservedbypathologicalimageanalysis.Results:1.FromthehumanumbilicalcordcanbeisolatedfromhUCMSCs,thepositiveexpressionofCD44andCD29,andnegativeexpressionofCD34andCD45;itconsistentwiththecellphenotypeofMSCs;2.Comparedwithshameoperationgroup,thealveolarstructuralinemphysemaexhibitedmoredisorder;alveolarcavitymoreirreguarenlargement;alveolarwallmorethinner,meanwhiledestructioninsomedegrees.TheMorphologicalQuantitativeAnalysisshowedNAdecreased,MAAandMLIincreased(P<0.05);3.Theresultsrevealedthat,thepositivitynumberofBrduinthelungtissueofratswas（21.14±7.9）、（3.02±1.85）in1,14daysrespectively;4.Histological(hematoxylinandeosinstaining)showstreatmentwithhUCMSCsreducedtheelastase-inducedemphysema,whereasgroupBdidnotreducethesechanges.ComparedwithgroupN,theNAdecreasedandtheMAA,MLIincreased(P<0.05);meanwhilegroupAcomparedwithgroupBandgroupC,theNAincreasedandtheMAA,MLIdecreased;thestatisticalsignificanceoccuredinNA,MAAandMLI(P<0.05).ButgroupBcomparedwithgroupC,theredidnothavestatisticalsignificance(P>0.05).Conclusion：1.PurificationandamplificationofHUMSCwereperformedsuccessfullyinourexperiment;andrepeatedpassagecanstillmaintaintheiroriginalmorphologicalcharacteristics;2.Weestablishdethemodelofemphysemasuccessfullybyintratrachealinstillationofporcinepancreaticelastase(1U/g);3.Humanumbilicalcordmesenchymalstemcellsindamagedorganslungdistributionproportionofadvantage,thatstemcellsintodamagedorganaggregationproperties;itobtainednoobviousimmunerejection,descriptionofumbilicalcordmesenchymal8 安徽医科大学硕士学位论文stemcellsderivedfromextremelylowimmunogenicity,anditcanbeusedasimportantsourcesofmesenchymalstemcells.4.TherewasasignificanthistologicalimprovementintheseverityoflunginjuryfollowinghUCMSCsadministration.Thetransplantationofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellscanmigratetotheinjuredlungtissue.OurstudyfurthersupportsthenotionthathUCMSCsexertedtheirtherapeuticbenefitthroughtheproductionofsolublefactorsatbioactivelevelsthatamliorateelastase-inducedemphysematousdamage.Keywords:emphysema/humanUmbilicalCordMesenchymalStemCells/transplantation/colonization;9 安徽医科大学硕士学位论文人脐带间充质干细胞移植对肺气肿大鼠模型的影响1.前言慢性阻塞性肺疾病（Chronicobstructivepulmonarydisease,COPD）是世界范围内的一种普遍性疾病，目前全世界大约有2亿患者，每年大约有三百多万患者[1]死于该病。世界卫生组织统计，在过去的20年，COPD的死亡率上升了2倍多。[2]在中国，按照目前的状况估计到2030年大约会有三百万人死于COPD。COPD的特征是气道的慢性炎症和进行性的肺实质组织的破坏。COPD在形态学上主要表现为两大病理特征：一是主要在小气道即直径小于2毫米的气道内的毛细支气管炎，二是肺气肿。肺气肿主要表现为终末细支气管远端肺组织的扩[3]张和结构破坏、气道重建，从而引起肺弹性减退、气道阻力增加，肺功能受损。过去20年对COPD中肺气肿和气道重建做了大量研究，但其具体机制仍没有完[4]全明确。主导的理论之一是“炎症假说”，研究者们认为在一些易感人群中，环境如空气污染和吸烟引起的肺部炎症从开始的正常反应变成了异常反应；特征表现为在环境暴露程度的某一点会引起过度的免疫反应，包括先天性的和后天获得性的。异常的免疫反应在病情发展中进一步放大。炎症细胞如中性粒细胞、巨噬[5][6][7]细胞和淋巴细胞会引起蛋白水解和氧化应激，从而使肺组织结构破坏。此外，血管内皮生长因子介导的气道上皮细胞的凋亡引起的气道上皮受损和血管重建[3]在COPD的进展中起了重要作用。有趣的是，一旦炎症反应在肺内牢固建立后，[8]即使环境刺激因素去除，仍不能完全消除气道内异常的炎症反应。对COPD的治疗，除了家庭氧疗能改善一小部分戒烟患者的动脉低氧血症外，几乎没有其他[9]明确的方法能够延长患者的生存时间，也没有任何治疗方法能够完全恢复COPD受损的肺功能。因COPD的特征表现为正常肺组织的丧失和气道的重建，因此目前越来越多的研究者热衷于应用干细胞和祖细胞再生出健康的肺实质组织和气道细胞，从而恢复COPD患者的肺功能。正常情况下呼吸道上皮细胞的更新非常缓慢，这和增殖能力强、更新快速的10 安徽医科大学硕士学位论文表皮及肠道上皮细胞完全不同。气管、支气管和肺泡内均有不同的干细胞或祖细[10]胞，他们有着各自不同的细胞生理特征。呼吸道受损后这些干细胞或祖细胞可以分化成相应的上皮细胞对呼吸道起到修复作用，具体的内源性的诱导分化机制因为缺乏相应的标记物和其他技术受限而尚不明确。内源性的干细胞和祖细胞对呼吸道的修复作用非常有限，一旦损伤程度超过修复能力，就会表现为相应的病[11]理生理变化，从而肺组织破坏受损，肺功能减退。胚胎和成体的干细胞在体外均能诱导分化成多种组织细胞包括呼吸道和肺泡上皮细胞。间充质干细胞（Mesenchymalstemcells,MSCs）是来源于中胚层的非造血干细胞，是干细胞家族的重要成员，具有分化成间质及非间质细胞等多种细胞的能力。MSCs最初在骨髓中发现；脐带来源间充质干细胞（UCB-MSCs）与骨髓来源的MSCs相比，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方[12,13]便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征。MSCs在临床治疗方面具有很大的潜能，主要因为其低表达HLAI类及II类[14]抗原和共同刺激分子，从而逃避免疫系统的自身识别。在具有正常免疫力的患[15]者中，MSCs能够抑制同种异基因的T细胞的增殖，逃避免疫识别。MSCs的这种免疫调节特性可能是通过分泌可溶的免疫调节因子和抑制细胞之间相互接[16]触实现的，但具体的机制仍不明确。在博来霉素诱导的肺损伤小鼠模型中，系[17]统的给予MSCs能够减低胶原蛋白的聚集，纤维化和金属蛋白酶量；其中具体[18]的机制之一可能是MSCs能够分泌白细胞介素受体的拮抗剂。在内毒素诱导的肺损伤模型中，气管给予MSCs可以降低死亡率，抑制组织炎症产生和降低支气[19]管肺泡灌洗液中炎症介质的浓度，包括TNFα和MIP1β。最近有研究表明在内毒素损伤模型中，MSCs可以通过分泌angiopoietin-1稳定呼吸道上皮细胞的胞[20]膜，抑制胞液外漏，维持肺泡毛细血管屏障功能，以上研究均提示了间充质干细胞修复受损肺组织中的重要作用。部分学者应用干细胞治疗急性肺损伤、肺纤维化等大鼠模型取的了一定效果，关于其对肺气肿是否有同样的治疗作用，目前研究甚少。本课题将人脐带间充质干细胞应用于肺气肿损伤大鼠模型内，并观察其在肺内的定植情况和治疗效果。11 安徽医科大学硕士学位论文2实验材料2.1实验动物SPF级健康雄性SpragueDawley（SD）八周龄大鼠，体重180～220g，由安徽省实验动物中心提供，置于清洁环境下饲养观察，环境温度21±3℃，相对湿度60%，自然光线采光，自由取水，普通饲料喂养。用龙胆紫溶液（紫色）在大鼠不同部位标记，随机分为四组：hUCMSCs+模型组、PBS+模型组、模型组、假手术组，每组10只，并统一称重和记录。2.2主要仪器和设备仪器名仪器来源微量输液泵WZ-50c6浙江浙大医学仪器有限公司电子分析天平SARTRIUS北京赛多利斯天平有限公司超净工作台上海恒宇医用器械厂细胞培养箱THermoForma公司2培养瓶25cmCoring公司自动组织脱水机TS-12U孝感市宏业医用仪器有限公司自动组织包埋机EM-Ⅱ型B021020安徽电子科学研究所石蜡切片机LEICARM2135Germany光学显微镜OLYMPUSCH20Japan图像采集系统Nikon&SpotU.S.A荧光显微镜日本Olympus公司倒置显微镜日本Olympus公司冰冻切片机日本Olympus公司12 安徽医科大学硕士学位论文自动酶标仪美国Bio-Tek公司MetaMorph图像分析软件UniversalImagingU.S.A-80℃超低温冰箱日本三洋公司普通冰箱合肥美菱股份有限公司电热干烤箱北京医疗器械厂各种规格的微量加样器德国、芬兰各种规格冻存管、EP管合肥欣乐生物有限公司电热恒温水浴锅上海医疗器械五厂DK-8D型电热恒温水槽上海实验仪器总厂台式高速离心机上海安亭科学仪器厂不锈钢压力蒸汽灭菌器上海三申医疗器械有限公司2.3主要试剂试剂名称试剂来源猪胰蛋白酶（PPE）美国罗氏公司完全培养基α-MEM北京医科利昊生物有限公司BrduSigma公司DAPI工作液Sigma公司II型胶原酶Sigma公司2.5%胰蛋白酶Sigma公司0.25%胰蛋白酶Sigma公司TritonX-100Sigma公司山羊抗大鼠Brdu一抗美国Abcam公司13 安徽医科大学硕士学位论文兔抗山羊lgG-FITC二抗美国Abcam公司小鼠抗大鼠单克隆抗体CD44-PE、CD45-PE、美国Becton-DickinsonCD29-PE、CD34PE其它：1.动物台，止血钳，手术剪，手术刀，结扎线，镊子，无菌手套，乙醚麻醉盒，一次性注射器(lml、5ml、10ml及50ml若干四号针头和纱布)，福尔马林，水合氯醛，瑞士染色液体。2.PBS缓冲液按使用说明称量定量PBS粉剂溶于1000ml蒸馏水中，使其浓度为0.01mol/L，调整pH值范围为7.2～7.4，高压灭菌，室温保存。3.青/链霉素双抗母液配制取青霉素一支80万单位，加入无菌ddH2O3.2ml，配成25万单位/ml青霉素母液;取链霉素一支100万单位，加入无菌ddH2O5ml，配成20万单位/ml链霉素母液;再取青霉素母液2ml(共50万单位)和链霉素母液2.5ml(共50万单位)，用无菌ddH2O稀释至总体积50ml，即为1万单位/m1青/链霉素双抗母液，使用时稀释100倍即得到100u/m1的终浓度。3.实验方法3.1实验分组健康雄性SD大鼠40只，随机分为4组，hUCMSCs+模型组、PBS+模型组、模型组、假手术组；并用龙胆紫(紫色)做标记。14 安徽医科大学硕士学位论文组别代号样本个数hUCMSCs+模型组A组10PBS+模型组B组10模型组C组10假手术组N组103.2动物饲养大鼠饲养环境保持通风、恒温、安静，定期消毒笼具；每天食用由安徽医科大学动物实验中心提供的普通颗粒型饲料，每天更换饮水，三天更换一次垫料。3.3实验造模和干预步骤随机分组hUCMSCs+模型组(A)、PBS+模型组(B)、模型组(C)、假手术组(N)；每组各10只大鼠。分别称体重后，用10％的水合氯醛(300ml/kg)腹腔注射麻醉，大鼠仰卧，四肢及头部固定于操作台上，操作台头部抬高约15度。常规消毒，纵向切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织及胸骨舌骨肌，暴露出气管，4号针头刺入气管软骨环间隙内，使用微量输液泵，A、B、C组分别一次性滴入配制的1U/g猪胰蛋白酶生理盐水溶液1ml/kg，N组注入等量的生理盐水。并注入少量空气保证试剂或生理盐水全部进入气管，立即直立动物并旋转体位数次，并按摩双侧胸部，使试剂均匀分布于双侧肺，缝合皮肤，切口消毒。将鼠放入独立鼠笼中，注意保湿，等清醒后放入原盒中。光照/黑暗时间各12小时。均饲养76d后。hUCMSCs+模型组(A）予以用Brdu标记的hUCMSCs尾静脉注射，量为61×10/ml；PBS+模型组(B)予以PBS尾静脉注射，量为1ml；模型组(C)及假手术组(N)不予任何干预处理，各组继续饲养至14天后处死所有大鼠。3.4人脐带间充质干细胞的分离、培养、保存及鉴定3.4.1人脐带间充质干细胞的取材、分离和培养1）取无污染的足月剖宫产健康胎儿脐带，用含200U/ml青、链霉素的磷酸缓冲液（PBSPH=7.4）反复冲洗，去除残留的血液，用剪刀小心剔除脐动、静脉。2）用剪刀将脐带组织切割成体积约1mm×1mm×1mm的组织块，放入无15 安徽医科大学硕士学位论文菌试管中，加入1%II型胶原酶37°C消化2h，中间间断震荡混匀，再加入2.5%胰酶3~5ml继续消化30min，加入血清3~5ml终止消化。3）用200目过滤网过滤，去除未消化的组织。将获得的消化液用培养液稀释后，2500rpm离心20min。将底层沉淀物培养液重悬后，继续以2000rpm离心20min，后加入4ml培养液，轻轻吹打，制成细胞悬液；后取少量细胞悬液血细胞板进行计数。524）将分离的细胞调整密度为5×10/cm接种于T-25cm2的培养瓶中。接种前在培养瓶中加入α-MEM培养基（含10%胎牛血清、100U/m1青霉素、100U/ml链霉素、2mmol/L谷胺酰胺、5ng/mlEGF）。5）置于含有5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养。48~72h后细胞换液，去除非贴壁细胞，以后每三天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及克隆形成情况，待细胞融合约80%以上后进行消化传代培养。3.4.2人脐带间充质干细胞的传代2将T-25cm的培养瓶置于5%CO2、37℃饱和湿度培养箱培养，三天后，首次换液，以后每2-3天换液一次，每天倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞克隆逐渐形成，覆盖瓶底的80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化以1：2传代；具体步骤：1）待细胞生长融合达80%-90%时，取出培养瓶放入事先消毒的超净工作台上，轻摇数次后吸出旧培养液，置于装废弃液的大烧杯中。用无菌玻璃吸管，吸取无菌PBS溶液延非细胞生长面注入培养瓶中，轻摇数次冲洗细胞培养面，后吸掉PBS溶液；PBS冲洗共计3次（充分摇匀），2）用移液器吸取0.25%胰酶消化液（加入量以刚覆盖培养瓶底部即可，225cm量约0.5ml），缓慢注入培养瓶内，轻轻晃动培养瓶使消化充分覆盖所有细胞表面，后细胞面置于手掌中；3）2-3分钟后可在倒置显微镜下观察，当绝大部分细胞收缩变成圆形、细胞间隙增大后，加入含10%FBS的α-MEM培养基5ml终止消化。4）用玻璃吸管吸取培养瓶内液体，反复吹打贴壁的细胞，吹打过程中按顺序进行，从培养瓶一侧边开始至另一侧结束，以确保所有底部都被吹打到。操作过程中，动作要轻柔，避免吹打出气泡；16 安徽医科大学硕士学位论文5）用玻璃吸管将培养瓶中的细胞悬液转移至离心管中，置于离心机中，转速为1000rpm×5min。6）小心吸取离心管中上清液，管底细胞沉淀层用标准培养液4ml吹打成细胞悬液，27）用移液器分别向2个T-25cm培养瓶中各加入3ml完全培养液，后用玻2璃吸管将4ml细胞悬液均匀移入2个T-25cm培养瓶中，标记为P1，置于含有5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养。3）以后每2-3天消化传代一次，以上述步骤1:2传代，传代后标记为P2，继续予以原培养液培养；以后传代培养标记为P3、P4....3.4.3人脐带间充质干细胞的冻存和复苏1）冻存：取生长良好的P3代细胞，0.25%的胰酶消化制成细胞悬液，用血细胞板计数后离心，弃去上清液，调整细胞密度为1-5×106/ml，加入适量的冻存液，吹打均匀制成细胞悬液。小心转至冻存管中，1.0ml/管，标签标记后，4℃×1h，﹣20℃×3h，﹣80℃过夜，后置于液氮罐中保存；2）复苏：2.1）将冻存于液氮罐中P3代的hUMSCs细胞取出，立即放入37℃水浴箱中以顺时针不断轻轻晃动，1min内融化细胞冻存液；2.2）用75%酒精将冻存管擦拭干净，置于超静工作台上2.3）用移液管将冻存管中的细胞移入含9ml培养液的离心管中，1200rpm离心20min，弃上清；2.4）加4ml培养基重新悬浮细胞，轻轻吹打均匀，接种于T-25cm2培养瓶中；后置于含有5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养；2.5）24h左右换液，去除未贴壁细胞；3.5人脐带间充质干细胞表面标志物的鉴定将P3代细胞标记流式抗体，即小鼠抗大鼠单克隆抗体CD45-PE，CD34-PE，CD29-PE，CD44-PE，通过流式细胞仪的检测，具体操作如下：1）收集P3代细胞，0.25%胰酶消化，用PBS反复吹打制成细胞悬液，1500rpm离心5min，弃去上清，PBS洗2遍；52）用200µlPBS重悬2.0×10cells，加入相应的抗体原液2µl，混匀后室温17 安徽医科大学硕士学位论文避光孵育30min；3）加入4%多聚甲醛进行固定，多聚甲醛的终浓度为1-2%；4）流式细胞仪检测，WinMDI2.9软件进行分析。3.6Brdu标记细胞：1）取P3代hUCMSCs接种于6孔板中，6孔板中事先放入无菌盖玻片（22mm×22mm）；52）每孔加入细胞悬液100μl，约1×10个细胞；3）加入完全培养基α-MEM5ml，置于含有5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中孵育24小时后；4）加入终浓度为10µmol/LBrdu，继续置于上述条件下培养，待细胞铺满盖玻片约80%以上；5）取出盖玻片，PBS冲洗后，多聚甲醛固定，行免疫荧光染色。3.7细胞免疫荧光步骤1）取出细胞爬片放到细胞培养皿里，PBS漂洗5min×3次；2）4％冷多聚甲醛固定10min；3）PBS漂洗5min×3次；4）0.2％TritonX-100孵育10min；5）PBS漂洗5min×3次；6）滴加5%山羊血清封闭液，封闭30min，室温；7）吸去多余封闭液，滴加一抗4℃湿盒内过夜，8）次日取出，室温下复温1h；9）PBS漂洗5min×3次；10）滴加二抗37℃孵育1.5小时（避光）；11）PBS漂洗5min×3次12）滴加DAPI工作液孵育30min；13）抗荧光淬灭剂封片，指甲油封盖玻片的四周；14）荧光倒置显微镜下观察，拍照；15）以PBS代替一抗作为空白对照。结果：在荧光倒置显微镜下Brdu标记的细胞核呈绿色荧光；DAPI标记的细胞核成18 安徽医科大学硕士学位论文蓝色荧光。阳性标记率=同一视野下绿色荧光数目/蓝色荧光数目×100%；根据3次不同细胞样本的实验结果得出细胞Brdu标记阳性率平均值。3.8HE染色1.取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，行3μm切片。2.脱水步骤如下：75％乙醇24h85%乙醇2h95%乙醇2h100%乙醇15min100%乙醇30min100%乙醇30min二甲苯15min二甲苯30min二甲苯30min石蜡30min石蜡30min石蜡2h石蜡切片脱蜡至水二甲苯Ⅰ10min二甲苯Ⅱ10min100%乙醇5min95%乙醇5min75%乙醇5min纯净水洗3.HE染色的步骤：（1）试剂配制：1）改良苏木素液配置苏木素2g无水酒精250ml硫酸铝17.6g蒸馏水750ml碘酸钠0.2g冰醋酸20ml配法：先将苏木素溶于无水酒精于蒸馏水，然后两液混合后加碘酸钠，最后加冰醋酸。此液为半氧化苏木素液，不会产生沉淀。2）沉淀酸化伊红Y乙醇液配置19 安徽医科大学硕士学位论文伊红Y4gddH2O100ml配法：伊红溶于蒸馏水中，然后加浓盐酸2ml，充分搅拌，静置过夜后过滤。用一张大号滤纸过滤。滤液不要，用ddH2O洗涤留在滤纸上的沉淀，并冲洗几次，再过滤，将沉淀物连同滤纸一起放入温箱内干燥，加95%酒精100ml，配成饱和液。（2）具体步骤：改良苏木素染液5min流水冲液10min1%盐水乙醇分化95%乙醇（过）盐酸乙醇沉淀伊红10s75%乙醇数秒95%乙醇（过）100%乙醇（过）100%乙醇（过）二甲苯Ⅰ5min二甲苯Ⅱ5min中性树胶封片镜检观察并拍照：细胞核应呈蓝色，细胞浆及其它组织呈粉红色。3.9肺泡形态计量学观察：每张切片在光镜下10×10倍随机采集5个视野，互不重叠，测量时避开支气管和大、中血管。在光学显微镜下10×10倍数码采集5个视野，观察：利用Metamorph4.0软件分析平均肺泡面积（MAA）：计数每个视野内的肺泡数（NA），测出每个视野的面积TA，HE染色阳性区域（肺实质）的面积（PA），以MAA=（TA-PA）/Na计算每个视野的平均肺泡面积；平均内衬间隔（MLI）：在显微微机彩色图象分析系统上，以视野正中为中心划“+”字交叉线，计数经此交叉线的肺泡间隔数（NS）。测出“+”字线总长度（L），以MLI=L/NS得到平均内衬间隔。20 安徽医科大学硕士学位论文3.10冰冻切片免疫荧染色hUCMSCs干预组大鼠分别于d1、d14处死，取组织行快速冰冻切片（5张）。1）冰冻切片厚度10µm，冻切片室温放置30min；2）PBS漂洗5min×3次；3）加0.3%TritonX-100室温孵育30min；4）PBS漂洗5min×3次；5）滴加5%山羊血清封闭液封闭，30min，37℃；6）吸去多余封闭液，滴加一抗（山羊抗大鼠Brdu），4℃过夜；7）次日取出切片，室温下复温1h；8）PBS漂洗5min×3次；9）滴加二抗（兔抗山羊lgG-FITC）避光，1.5h，37℃；10）PBS漂洗5min×3次；11）加入适量抗荧光淬灭剂后封片，指甲油封闭盖玻片四周；12）荧光倒置显微镜下观察。13）每张切片随机选取10个视野（200倍），观察绿色荧光表达情况，计荧光细胞数并取平均值。3.11统计分析方法各组计量资料均以均数（xs）表示，采用SPSS11.5统计软件进行多组比较方差分析和组间比较用SNK法，P<0.05表示差异有统计学意义。4结果4.1hUCMSCs的培养及标记原代培养2~3d后，可见少量贴壁细胞，细胞不均一，呈圆形或内皮细胞样；培养1w后，镜下可见细胞呈梭形，有胞浆突起，呈成纤维细胞样，10天左右细胞融合达80%以上，传代后细胞呈均匀分布的长梭形生长，平行或螺旋状排列（见图1A）。倒置荧光显微镜下可见Brdu标记的细胞核呈绿色(见图1B），DAPI标记的细胞核呈蓝色（见图1C）；荧光标记阳性率达90%以上（见图1D）。21 安徽医科大学硕士学位论文图1倒置荧光显微镜下细胞形态×200A：未标记的P3代细胞B：Brdu标记C：DAPI标记D:箭头：Brdu+DAPI双标4.2细胞表面分子检测通过流式细胞术检测hUCMSCs表面标记，利用WinMDI2.9软件分析结果。如图2所示：hUCMSCs阳性表达CD44和CD29，而造血细胞及内皮细胞标志物CD34和CD45均阴性表达，与MSCs的细胞表型一致。22 安徽医科大学硕士学位论文图2流式细胞术检测hUCMSCs表面分子标志4.3大鼠肺组织病理学4组大鼠肺组织切片的HE染色显示：除N组以外，A组、B组、C组的大鼠的肺组织均出肺泡腔不规则扩大，肺泡壁变薄，并有不同程度的断裂。但A组较B组、C组肺气肿改变明显减轻，见图3。肺泡形态学结果显示:A组、B组、C组与N组比较，NA减少，MAA增大，MLI增大，差异均有显著性(P<0.05)；同时A组与B组、C组比较：NA增多，MAA减小，MLI减小，差异有显著性(P<0.05),；但B组与C组之间，NA、MAA及MLI均无明显差别，差异无显著性（P>0.05)，（见表1、图4）。23 安徽医科大学硕士学位论文图3各组大鼠肺组织HE染色×200A：hUCMSCs+模型组B：PBS+模型组C：模型组N：假手术组表1各组大鼠肺组织病理学的比较（xsn=10）平均肺泡面积平均内衬间隔组别n平均肺泡数/个2/µm/µmA10178.8±15.86*8012±1429*90.27±11.94*▲▲▲B1095.70±15.64*12049±2979*108.59±17.72*▲▲▲C1098.00±9.59*11256±2760*119.34±11.43*N10250.70±18.055775±93653.71±9.88▲注：与N组比较：*P<0.05；与A组比较：P<0.05A：hUCMSCs+模型组B：PBS+模型组C：模型组N：假手术组24 安徽医科大学硕士学位论文图4.各组大鼠肺组织病理形态学指标比较。▲注：与假手术组比较：*P<0.05；与hUCMSCs+模型组比较P<0.014.3免疫荧光检测移植的hUCMSCs在大鼠肺组织中的存活情况并计数hUCMSCs+模型组大鼠分别于移植后的d1、d14各处死一只，倒置荧光显微镜下观察。结果：两个时间点肺组织内均可见到绿色荧光表达，每个视野下Brdu阳25 安徽医科大学硕士学位论文性细胞数分别为（21.14±7.9）、（3.02±1.85），见图5；同时检测脾、肾、肝、心等组织均未见到或罕见到绿色荧光表达，结果表明外源性的干细胞在受损的肺组织内有表达，且停留时间达到14天。图5免疫荧光检测Brdu标记的hUCMSCs在肺组织定植情况×200A：移植后d1B：移植后d145.讨论MSCs是一种多功能干细胞，在目前的研究领域，以骨髓来源的MSCs占据主要地位，由于其没有伦理学问题及自体移植不存在免疫排斥反应，同时还具有[21]向损伤和炎症部位迁移的特性。但骨髓来源的MSCs仍有其缺点存在，如必须通过有创途径获得，而且随着年龄的增长，体内干细胞的数量逐渐减少，很难[22]分离和培养，在数量上不足以满足临床移植的需要。[23][24][25][26]这些年来在胎儿的附属物中如羊膜、羊水、脐带及脐带血中发现了丰富的MSCs，而其具有更低的免疫原性、更高的增殖潜能及来源方便等优越性；使其越来越成为干细胞的主要来源；其中脐带来源的MSCs最丰富。脐带，是胎儿分娩后的废弃物，其在胚胎发育过程中有羊膜囊扩大包围体蒂及卵黄囊而形成的索状物，外周有羊膜构成，内为来自中胚层的胶样结缔组织，成为Wharton'sJelly胶（华尔通氏胶），其内含有1条静脉和2条动脉。从胚胎发育的角度看，很多全能或多能干细胞均需从卵黄囊经华通氏胶到达胚胎进一步形成相[27]应的组织细胞，因此，脐带很有可能富含丰富的原始细胞并且可能成为获得丰富干细胞来源的组织。本实验采用胶原酶、胰酶联合消化法结合贴壁筛选法分离培养人脐带间充质干细胞，获得的贴壁细胞且多次传代后仍能保持形态上的稳定，形态上和文献报26 安徽医科大学硕士学位论文[28.29]道的hUC-MSCs是一致的；我们选取公认的MSCs特异性细胞表面标志物[30,31]进行流式细胞术测定，证实脐带分离培养的hUCMSCs高表达CD29、CD44，而内皮细胞及造血细胞表面标志物CD34、CD45等均表达阴性，说明我们建立的分离培养hUCMSCs的方法是成功可行的。干细胞作为种子细胞进行体内细胞移植是干细胞目前主要的应用，然而良好的示踪标记对研究移植细胞在体内的迁徙、定植、生长及分化等方面尤为重要。[32]目前对于干细胞的标记方法主要有荧光染料标记（Dil标记）、核素标记[33][34]（3H-TdR标记）、磁标记细胞MRI活体示踪成像以及Brdu标记法等。其中BrdU作为DNA前体胸腺嘧啶核苷酸的类似物，其在细胞合成期（S期）与内源性的胸腺嘧啶核苷酸竞争掺入DNA中，并随细胞增殖传代。理论上只要细胞不凋亡，掺入的BrdU将永久的存留在DNA中，而且受细胞内外环境影响小，标记不会丢失，后期通过与抗Brdu单克隆抗体结合，检测其在体内的分布情况。基于上述特性，本实验采用终浓度为10µmol/L的Brdu孵育hUCMSCs48h，通过DAPI复染所有细胞核，发现其荧光标记阳性率达90%以上，且细胞生长形态特性未见明显改变；因此我们认为采用BrdU标记hUCMSCs是可行的，且标记率高。有研究提示，炎症反应本身可以刺激并诱导骨髓干细胞迁徙至受损组织中，[35]参与损伤的修复；当损伤超过了自身的修复能力或损伤破坏了内源性的修复机制时，则表现成损伤的持续加重；此时输注外源性的MSCs辅助适宜的条件将有可能延缓，甚至逆转疾病的进展；然而MSCs对疾病发挥作用的首要前提是在靶器官的定植。在本实验中通过免疫荧光检测hUCMSCs+模型组大鼠肺组织，[36][37]观察到移植的hUCMSCs向肺损伤部位迁移，这与Ortiz、Rojas等的研究发现在受损组织中有移植干细胞的表达结果是一致，这点进一步提示炎症损伤环境可能会诱导外源干细胞向肺局部归巢。众多研究证实，循环中的MSCs具有多器官归巢的能力，其向受损组织迁[38][39]徙能力与干细胞自身表达不同的细胞因子受体及贴壁分子有关，如SDF-1、[40]PDGF；最近研究证实在肾损伤的大鼠模型中，CD44和透明质酸可以募集外[41]源性的MSCs迁徙至受损的肾组织，促进组织修复。在本实验中我们可以观察到hUCMSCs移植后肺组织损伤明显得到改善；推测与肺脏组织自身结构的特27 安徽医科大学硕士学位论文殊性密切相关，如丰富的微循环系统、血流量大；使得经静脉移植的MSCs大部[42]分被崁顿在肺毛细血管网中。此外，受损组织常伴有血管损伤或炎症反应造成的血管通透性增加，有利于MSCs从血管中游走进入受损组织，参与组织的修[53]复。这点相对于MSCs移植到其他脏器而已，是必会影响到干预效果；但是此途径输注MSCs对于肺组织疾病而言，则是一个天然的优势；使得外源性的MSCs逃避了各个脏器的“拦截”，直接于肺组织接触；当其崁顿于毛细血管网中，则有机会与周围微环境及组织细胞相互作用，进而迁徙至肺间质、肺泡壁等结构中发挥其生理效应。同时我们实验发现在hUCMSCs移植后第1天，在肺组织中可以检测到大量的阳性细胞，说明经尾静脉移植的干细胞能够在肺组织中停留，为其发挥修复作用提供了机会。进一步研究发现在第14天，hUCMSCs+模型组中大鼠肺组织仍能检测到标记的细胞，均提示外源性给予的hUCMSCs存在于受损的肺组织，且可停留足够长的时间发挥生理效应。但是我们观察到局部定植的细胞数目明显减少，分析其原因可能与：1.受损肺组织损伤逐渐修复，其对hUCMSCs的诱导趋化作用降低，从而使hUCMSCs向肺组织迁移减少；2.Brdu标记的细胞经过自身的细胞分裂，Brdu被子代细胞平分，导致细胞内Brdu含量过低而无法检测；3.部分Brdu标记的hUCMSCs不能适应局部的微环境而死亡导致阳性细胞数减少。与此同时我们也检测干预组大鼠其他重要脏器，如脾、肾、肝、心等组织，结果均未见到或罕见到绿色荧光表达。因此我们推测可能与其组织结构正常，或经过循环后仅有极少数细胞滞留组织；同时在没有明显的炎症微环境条件诱导下，局部的hUCMSCs快速被清除掉或输送走有关。同时我们通过行石蜡切片，HE染色光镜下观察各组大鼠肺组织可见：N组大鼠肺泡壁无明显增厚，同视野下所见肺泡数目较多，肺泡大小均匀；B组、C组大鼠肺组织中可见肺肺泡囊及肺泡腔的扩大，同视野下所见肺泡数目减少，且肺泡腔出现不规则扩大、大小不均；可见多个肺泡融合所致的肺大疱；A组大鼠肺组织可见少许肺大疱，肺泡腔不规则扩大，但程度上较B组和C组有所减轻。进一步行肺组织半定量分析，结果显示：与N组相比，B组及C组大鼠肺组织中NA减少，MAA、MLI明显增大，且差异均有显著性(P<0.05)，表明肺泡间隔出现破坏，肺泡融合扩大形成肺大疱，出现了肺气肿的形态学变化。同时我们检测A组大鼠肺组织形态学，与B组或C组比较，NA增多，MAA、MLI减小，28 安徽医科大学硕士学位论文差异也有显著性(P<0.05)。从一定程度上证实了hUCMSCs干预可以改善肺组织损伤程度，在某种程度上促进组织的修复。我们分析其机制可能与组织损伤后可分泌一系列炎性因子，可造成组织的破坏和细胞凋亡，hUCMSCs可与炎症细胞相互作用，通过调节不同细胞因子的释放发挥抗炎作用，减轻组织损伤程度，促进组织修复。这点在本课题组的前期研究得到了证实，予以尾静脉注射hUCMSCs后用ELLSA法检测各组大鼠血清及BALF中IL-1β、TNF-α及IL-10水平，发现干预组血清及BALF中IL-1β、TNF-α水平明显下降，同时IL-10的表达水平升高，差异具有显著性（P<0.05）；因此我们推测肺组织损伤的改善程度与IL-1β、TNF-α水平的下调及IL-10水平上调有关，且这点与相关的研究结[19]果也是一致的。Gupta证实骨髓MSCs可通过旁分泌作用增加IL-10的表达，[43]从而缓解肺损伤程度并提高老鼠生存期。Tögel的研究结果也表明MSCs干预后可以下调炎性细胞因子IL-1β、TNF-α及上调抗炎细胞因子IL-10、TGF-α水平，促进组织的修复。同时进一步的研究证实MSCs促进组织修复还可能与其上调抗[43][44]凋亡基因Bcl-2水平、分泌HFG，增强内源性VEGF和VEGF-2型受体促[45]进血管生成有关。新生血管的增多和血流动力学的改善有助于增加受损组织[46]的血氧供应，加快组织损伤的修复。在急性心肌梗死的大鼠模型中，输注MSCs至模型大鼠后，发现新生血管数量及血管密度均较模型组增加，且梗死范围明显[47]减小，心功能得到显著改善。本实验成功地从人脐带中分离、纯化并扩增了间充质干细胞，移植入本课题组成熟技术制造的大鼠肺气肿模型中，证明了间充质干细胞向炎症部位或受损脏器归巢的特性；未见明显免疫排斥现象，说明脐带来源的间充质干细胞免疫原性极低，可作为将来临床间充质干细胞的重要来源；移植后对肺气肿的进展发挥了一定的干预作用，其干预机制可能是通过间充质干细胞在局部或/和全身发挥了抗炎作用；间充质干细胞固有的定向分化特性可能参与促进肺小叶的修复和重构。这将为临床探索治疗肺气肿的崭新途径提供了极具重要意义的思路。6.结论1.从人脐带组织中可分离出hUCMSCs，传代后仍能保持MSCs原有的形态学特29 安徽医科大学硕士学位论文点；2.猪胰蛋白酶气管内滴入可制造出大鼠肺气肿模型；3.经尾静脉移植的hUCMSCs可在肺组织定植，随时间延长，细胞数量逐渐下降；移植后肺气肿大鼠肺泡形态学各项指标均明显改善，但未恢复至正常水平。7.研究不足和展望1.本实验证实hUCMSCs移植可以改善肺气肿大鼠肺损伤，前期研究发现可能与其旁分泌作用有关；但其是通过何种具体分子机制发挥其作用，有待本课题组进一步研究；2.缺乏hUCMSCs在肺气肿损伤模型应用中安全性的评估的内容；3.未能于连续的时间点观察肺损伤的修复程度，是否hUCMSC发挥其作用与时间有相关性；4.移植的hUCMSC向受损组织的归巢的具体机制、局部微环境对移植的hUCMSC有如何调控作用及如何提高移植hUCMSC在受损组织中定植和存活，有待本课题组进一步研究；5.目前，hUCMSCs移植治疗肺气肿尚处于动物实验阶段，仍有诸多问题有待完善，但其展现出巨大的潜在治疗价值；相信随着研究的深入及临床实验的经验积累，必能使hUCMSCs修复肺气肿迈出坚实的一步。参考文献：1.OrganizationWH.ChronicObstructivePulmonaryDisease(COPD).2009:FactsheetNo315.2.LinHH,MurrayM,CohenT,etal.Effectsofsmokingandsolid-fueluseonCOPD,lungcancer,andtuberculosisinChina:atime-based,multipleriskfactor,modellingstudy.Lancet.2008Oct25;372(9648):1473-83.30 安徽医科大学硕士学位论文3.HoggJC.Pathophysiologyofairflowlimitationinchronicobstructivepulmonarydisease.Lancet.2004Aug21-27;364(9435):709-21.4.SiafakasNM,AntoniouKM,TzortzakiEG.Roleofangiogenesisandvascularremodelinginchronicobstructivepulmonarydisease.IntJChronObstructPulmonDis.2007;2(4):453-62.5.ShapiroSD.Proteinasesinchronicobstructivepulmonarydisease.BiochemSocTrans.2002Apr;30(2):98-102.Review.6.MacNeeW.Pulmonaryandsystemicoxidant/antioxidantimbalanceinchronicobstructivepulmonarydisease.ProcAmThoracSoc.2005;2(1):50-60.7.CurtisJL,FreemanCM,HoggJC.Theimmunopathogenesisofchronicobstructivepulmonarydisease:insightsfromrecentresearch.ProcAmThoracSoc.2007Oct1;4(7):512-21.8.WillemseBW,tenHackenNH,RutgersB,etal.Effectof1-yearsmokingcessationonairwayinflammationinCOPDandasymptomaticsmokers.EurRespirJ.2005Nov;26(5):835-45.9.SinDD,McAlisterFA,ManSF,etal.Contemporarymanagementofchronicobstructivepulmonarydisease:scientificreview.2003Nov5;290(17):2301-12.10.KottonDN,SummerR,FineA.Lungstemcells:newparadigms.ExpHematol.2004Apr;32(4):340-3.Review.11.HackettTL,KnightDA,SinDD.PotentialroleofstemcellsinmanagementofCOPD.IntJChronObstructPulmonDis.2010Apr7;5:81-8.12.OmoriK,TadaY,SuzukiT,etal.Clinicalapplicationofinsitutissueengineeringusingascaffoldingtechniqueforreconstructionofthelarynxandtrachea.AnnOtol31 安徽医科大学硕士学位论文RhinolLaryngol.2008Sep;117(9):673-8.13.MacchiariniP,JungebluthP,GoT,etal.Clinicaltransplantationofatissue-engineeredairway.Lancet.2008Dec13;372(9655):2023-30.14.DominiciM,LeBlancK,MuellerI,etal.Minimalcriteriafordefiningmultipotentmesenchymalstromalcells.TheInternationalSocietyforCellularTherapypositionstatement.Cytotherapy.2006;8(4):315-7.15.VenturaC,CantoniS,BianchiF,etal.HyaluronanmixedestersofbutyricandretinoicAciddrivecardiacandendothelialfateintermplacentahumanmesenchymalstemcellsandenhancecardiacrepairininfarctedrathearts.JBiolChem.2007May11;282(19):14243-52.16.SueblinvongV,WeissDJ.Celltherapyapproachesforlungdiseases:currentstatus.CurrOpinPharmacol.2009Jun;9(3):268-73.Epub2009Apr6.Review.17.WeissDJ,KollsJK,OrtizLA,etal.Stemcellsandcelltherapiesinlungbiologyandlungdiseases.ProcAmThoracSoc.2008Jul15;5(5):637-67.18.OrtizLA,DutreilM,FattmanC,etal.Interleukin1receptorantagonistmediatestheantiinflammatoryandantifibroticeffectofmesenchymalstemcellsduringlunginjury.ProcNatlAcadSciUSA.2007Jun26;104(26):11002-7.19.GuptaN,SuX,PopovB,LeeJW,etal.Intrapulmonarydeliveryofbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsimprovessurvivalandattenuatesendotoxin-inducedacutelunginjuryinmice.JImmunol.2007Aug1;179(3):1855-63.20.XuJ,WoodsCR,MoraAL,JoodiR,etal.Preventionofendotoxin-inducedsystemicresponsebybonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsinmice.AmJPhysiolLungCellMolPhysiol.2007Jul;293(1):L131-41.32 安徽医科大学硕士学位论文21.PittengerMF,MackayAM,BeckSC,etal.Science.Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.1999;284(5411):143-7.22.RaoMS,MattsonMP.Stemcellsandaging:expandingthepossibilities.MechAgeingDev.2001;122(7):713-34.Review.23.MarcusAJ,CoyneTM,RauchJ,etal.Isolation,characterization,anddifferentiationofstemcellsderivedfromtheratamnioticmembrane.Differentiation.2008;76(2):130-144.24.DeCoppiP,BartschGJr,SiddiquiMM,etal.Isolationofamnioticstemcelllineswithpotentialfortherapy.NatBiotechnol.2007;25(1):100-6.25.MitchellKE,WeissML,MitchellBM,etal.MatrixcellsfromWharton'sjellyformneuronsandglia.StemCells.2003;21(1):50-60.26.LeeOK,KuoTK,ChenWM,etal.Blood.Isolationofmultipotentmesenchymalstemcellsfromumbilicalcordblood.2004;103(5):1669-75.27.KadnerA,ZundG,MaurusC,etal.Humanumbilicalcordcellsforcardiovasculartissueengineering:acomparativestudy.EurJCardiothoracSurg.2004;25(4):635-41.28.MaL,FengXY,CuiBL,LawF,etal.HumanumbilicalcordWharton'sJelly-derivedmesenchymalstemcellsdifferentiationintonerve-likecells.ChinMedJ(Engl).2005Dec5;118(23):1987-93.29.徐燕,李长虹,孟恒星,等.人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性[J].中国组织工程研究与临床康复.2009,13(32);6289-6294.30.DominiciM,LeBlancK,MuellerI,etal.Minimalcriteriafordefiningmultipotentmesenchymalstromalcells.TheInternationalSocietyforCellularTherapypositionstatement.Cytotherapy.2006;8(4):315-7.33 安徽医科大学硕士学位论文31.ParoliniO,AlvianoF,BagnaraGP,etal.StemCells.Concisereview:isolationandcharacterizationofcellsfromhumantermplacenta:outcomeofthefirstinternationalWorkshoponPlacentaDerivedStemCells.2008;26(2):300-11.32.KruytMC,DeBruijnJ,VeenhofM,etal.Applicationandlimitationsofchloromethyl-benzamidodialkylcarbocyaninefortracingcellsusedinboneTissueengineering.TissueEng.2003;9(1):105-15.33.BaiJZ,LiuZJ,DingWM,etal.Trackingneuralprogenitorcellstransplantedintorabbitspinalcordbydetectionofdopaminereceptor2withpositronemissioncomputedtomography.ZhonghuaYiXueZaZhi.2006;86(29):2060-4.34.AndersonSA,Shukaliak-QuandtJ,JordanEK,etal.MagneticresonanceimagingoflabeledT-cellsinamousemodelofmultiplesclerosis.AnnNeurol.2004;55(5):654-9.35.YamadaM,KuboH,KobayashiS,etal.Bonemarrow-derivedprogenitorcellsareimportantforlungrepairafterlipopolysaccharide-inducedlunginjury.JImmunol.2004Jan15;172(2):1266-72.36.OrtizLA,GambelliF,McBrideC,eta1.Mesenchymalstemcellengraftmentinlungisenhancedinresponsetobleomycinexposureandamelioratesitsfibroticeffects[J]．ProcNatlAcadSciUSA,2003,100(14):8407-8411．37.RojasM,XuJ,WoodsCR,eta1.Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsinrepairoftheinjuredlung[J].AmJRespirCellMolBiol,2005,33(2):145-152.38.FoxJM,ChamberlainG,AshtonBA,etal.Recentadvancesintotheunderstandingofmesenchymalstemcelltrafficking.BrJHaematol.2007;137(6):491-502.39.TögelF,IsaacJ,HuZ,etal.RenalSDF-1signalsmobilizationandhomingofCXCR4-positivecellstothekidneyafterischemicinjury.KidneyInt.34 安徽医科大学硕士学位论文2005;67(5):1772-84.40.BurtonCJ,CombeC,WallsJ,etal.Secretionofchemokinesandcytokinesbyhumantubularepithelialcellsinresponsetoproteins.NephrolDialTransplant.1999;14(11):2628-33.41.HerreraMB,BussolatiB,BrunoS,etal.ExogenousmesenchymalstemcellslocalizetothekidneybymeansofCD44followingacutetubularinjury.KidneyInt.2007;72(4):430-41.42.SchrepferS,DeuseT,ReichenspurnerH,etal.Stemcelltransplantation:thelungbarrier.TransplantProc.2007;39(2):573-6.43.TögelF,HuZ,WeissK,etal.Administeredmesenchymalstemcellsprotectagainstischemicacuterenalfailurethroughdifferentiation-independentmechanisms.AmJPhysiolRenalPhysiol.2005,289(1):F31-42.44.OkadaH,SuzukiJ,FutamatsuH,etal.Attenuationofautoimmunemyocarditisinratsbymesenchymalstemcelltransplantationthroughenhancedexpressionofhepatocytegrowthfactor.IntHeartJ.2007;48(5):649-61.45.ChenJ,ZhangZG,LiY,etal.Intravenousadministrationofhumanbonemarrowstromalcellsinducesangiogenesisintheischemicboundaryzoneafterstrokeinrats.CircRes.2003;92(6):692-9.46.MorigiM,IntronaM,ImbertiB,etal..Humanbonemarrowmesenchymalstemcellsacceleraterecoveryofacuterenalinjuryandprolongsurvivalinmice.StemCells.2008;26(8):2075-82.47.OhnishiS,YanagawaB,TanakaK,etal.Transplantationofmesenchymalstemcellsattenuatesmyocardialinjuryanddysfunctioninaratmodelofacutemyocarditis.JMolCellCardiol.2007;42(1):88-97.35 安徽医科大学硕士学位论文附录个人基本情况：姓名：程雪松出生年月：1986.11性别：男籍贯：安徽合肥专业：老年医学专业方向：老年呼吸系统疾病学习单位：安徽医科大学第一附属医院老年呼吸内科主要学习工作经历：2004.9-2009.7皖南医学院本科临床医学学士2009.9至今安徽医科大学研究生学院（老年医学）硕士研究生在校获奖情况2012年荣获安徽医科大学校三等奖学金在校期间参与的科研项目：安徽省教育厅自然科学基金资助项目：“全反式维甲酸干预大鼠肺气肿形成的机制研究”项目编号：KJ2009A118在校期间发表的文章：程雪松，王叶芳，王锦，韩晓燕，汪伟民.人脐带间充质干细胞对肺气肿模型大鼠细胞因子的影响.安徽医科大学学报,2012,47(3):270-273.36 安徽医科大学硕士学位论文致谢此研究论文完成之际，我在此对曾经给予我关心和帮助的人们，表示诚挚和衷心的感谢。首先，要特别感谢我的导师汪伟民主任。本研究是在导师的悉心指导下完成的，从课题设计、实验乃至成文均给予了具体、细致、详尽、科学的指导，我忠心地感谢老师对我孜孜不倦的教诲和无私的帮助，导师严谨的治学态度、敏捷的思维、渊博的知识、勤奋刻苦的风范、博大的胸怀、乐观的生活态度，以及孜孜不倦追求科学与真理的精神将使我受益终身，将成为我今后工作、学习和生活的榜样！在此，我要深深地给老师鞠躬以表达我无限的感激。特别感谢安徽医科大学第一附属医院老年呼吸内科、呼吸病诊疗中心一病区、二病区的刘荣玉主任医师、张姸蓓主任医师、张志红副主任医师、范晓云副主任医师、王炯副主任医师、徐轲主治医师、闫雪波主治医师、王聪慧主治医师等老师和护士对我临床工作的帮助和支持！深深感谢我的师妹王锦、师弟王叶芳在我实验上的帮助，同时感谢我的室友汪浩、朱洋波、程庆荣在我实验上的大力协助。本课题研究过程中得到了安徽医科大学第一附属医院动物房护士长及各位护士的帮助和支持，为我建立动物模型及采集标本创造了良好的实验条件，本人深表感谢！非常感谢安徽医科大学第一附属医院中心实验室老师在酶联免疫吸附试验、免疫荧光等实验技术上给予的悉心教导和帮助。感谢基础医学院黄大可老师在图像拍摄和分析方面的无私帮助和指导。最后，我更要感谢我的家人，他们的支持使我得以顺利完成学业。再次真心感谢曾经帮助和支持我的所有老师和同学！37 安徽医科大学硕士学位论文综述间充质干细胞与肺部疾病程雪松综述汪伟民审校间充质干细胞（MSCs）是来源于中胚层的干细胞，具有自我更新的增殖能力，在适宜的微环境里具有多向分化潜能。有学者认为，骨髓MSCs是一种循环的干细胞，在机体组织受损伤时，骨髓MSCs可经骨髓动员到达损伤部位，并在[1]局部微环境诱导下分化为特异的组织细胞参与自身修复。MSCs是近年来研究比较多并取得较大突破的成体干细胞，而且它具有取材方便获得，易于分离培养和扩增纯化，体外反复传代仍能保存多分化的潜能的特点，自体移植同时也克服了伦理道德和免疫排斥等特点，使得MSCs的研究越来越多。肺脏是人体重要的器官，由于其特殊的结构特性，使其易受到各种生物、物理和化学因素的损伤，目前诸多研究显示MSCs与肺损伤的修复密切相关。本文就MSCs的生物学特性及其与肺部疾病的相关研究作一综述。1MSCs概述1.1MSCs的分类与来源干细胞可分为三种类型：（1）全能干细胞，它具有分形成完整个体的分化潜能细胞，如胚胎干细胞。（2）多能干细胞，这种干细胞失去了发育成完整个体的潜能，但具有分化成多种细胞组织的潜能，如骨髓造血干细胞和骨髓间充质干细胞。（3）单能干细胞，只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化,如上皮组织基底层的干细胞，肌肉中的成肌细胞。在这三种类型干细胞中，胚胎干细可以分化成所有的成体组织，但是由于其受伦理学及免疫排斥等因素的影响，使其临床应用受到很大限制；但成体干细胞由于不涉及伦理问题且来源广泛，且可向绝大部分组织分化，使其成为目前研究的热点；干细胞来源报道最多的是来自骨髓，但是在肝、脾、肺、肌肉、胰、脑、肾等组织中也已[2]证明有MSCs存在。同时脐血、胎盘、脐静脉内皮、脂肪等组织中也可分离得[3，4]到。1.2MSCs的生物学特性MSCs在形态上呈纺锤形的成纤维细胞样，能附着在38 安徽医科大学硕士学位论文[5]塑料或玻璃培养皿上生长形成均匀的集落或贴壁的融合层，且具有自我更新能7[6]力强，性质稳定，体外扩增10倍后仍保持干细胞特性和正常表型，连续传代培养和冷冻保存仍有多向分化潜能的特性。目前MSCs并没有找到理想的特异性标志，它既有间质细胞的表面抗原，又有内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞的表面抗原，但不表达造血细胞的表面标志，如CD13、CD14、CD28、CD34、CD45、CD47等，也不表达与人白细胞抗原(HLA)识别有关的共刺激分子B71、B72及主要组织相容性复合物Ⅱ类分子如HLA-DR抗原等。MSCs表达的主要分子包括：[7][8](1)粘附分子：SH-2、SH-3、SH-4、CDl05、CD73、CD90、CDl06、、CD44、CDl20等。（2）细胞因子及其受体：白细胞介素（IL)-1、IL-2、IL-7、IL-8、IL-11、[9]IL-12、IL-14、IL-15和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）等及其细胞因子相应受体。（3）整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。MSCs作为一种多潜能细胞，在一定条件下可定向分化为成骨细胞、成软骨细胞、[10，11][12][13][14,15]脂肪细胞、神经细胞、肌肉细胞、肺和肾脏上皮细胞等，但是在正常生物体内绝大多数MSCs处于G0和G1期，即绝对静止期，只有在某些信号诱导下，其分化潜能才被激活，经过多个细胞分裂周期，最终分化成为某种成熟细胞。在理论上，MSCs可以无限地分裂和增殖，但实际上MSCs并不是永生不灭的，Burder指出。从人髂骨处取出的MSCs细胞经过体外培养(38±4)代后出现老[16]化现象。它的数量取决于患者的年龄、取材部位、全身状况和体外培养的环境[17]等。2MSCs与肺2.1肺部MSCs的基本生物学特点与来源肺部MSCs是指能不断自我更新并在特定条件下可以分化成有功能性肺组织的一类细胞；研究证实肺组织和支气管组织中均可分离出MSCs，其在体外培养、形态学及生长特性与骨髓MSCs相似；[18]SabatiniF等从成人支气管组织中分离培养出一种成纤维样细胞，它具有间充质干细胞表型；同时可以定向分化成脂肪、软骨和成骨，它们不表达细胞分化相关标志CD34，CD45和免疫相关表型HLA-DR(MHC-II类分子)、共刺激分子CD80和CD86，表达骨髓MSCs表面标记物CD29、CD44、CD73、CDl05、CDl66。同时，在肺组织的不同解剖区域中也分离出了与骨髓间充质干细胞表型和分化功能[19,20]相类似的细胞。过细胞周期分析显示90％以上为G0/G1期细胞，而S期和39 安徽医科大学硕士学位论文G2/M期细胞分别为5.56％和2.08％，且肺来源的MSCs在适当的条件下可被诱[21]导分化成脂肪、神经细胞、软骨和成骨细胞。此外，肺组织来源的MSCs也同样具免疫调控能力。体外培养的胎肺来源MSCs不仅不会引起T细胞的增殖，相反还能抑制单个核细胞和有丝分裂原引起的T细胞的增殖，其对T细胞增殖的抑制作用于MSCs数量呈正相关。3MSCs与肺部疾病3.1MSCs与肺纤维化肺纤维化是肺组织损伤后常见的病理过程，早期表现为的弥漫性肺泡炎、后期可为成纤维细胞过度增殖和细胞外基质过度沉积。Kotton等[22]将BMSCs植入到博来霉索诱导的肺损伤小鼠体内，在受体小鼠损伤肺泡上皮细胞周围发现了表达I型肺泡上皮细胞的T1α的供体细胞，但并未发现表达II型[23]肺泡上皮细胞的任何标记。Ortiz等研究显示，在博来霉素诱导肺损伤的早期，经静脉输注BMSCs，可改善肺部炎症反应，减少胶原沉积，对预防肺纤维化起到[24]一定的作用。赵峰等研究显示，在博来霉素诱导的肺纤维化模型中，MSCs移植可显著减轻肺组织间质的增生，其机制可能与MSCs降低转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的含量有关，从而减轻肺组织中成纤维细胞增生及胶原合成，减轻肺纤维化。3.2MSCs与原发性肺动脉高压原发性肺动脉高压（PAH）主要病理改变为肺[25]血管内皮细胞异常增殖导致肺血管重构。Hayashida等证实骨髓来源的干细胞移植可缓解低氧诱导的肺动脉高压，与其能分化成平滑肌细胞或肌纤维母细胞有关。同时研究显示，MSCs可以分化为内皮细胞和血管平滑肌细胞和促进血管生[26,27]成因子的分泌，从而形成新生血管，用于治疗心肌梗死及其它血管闭塞疾病。[28]何志旭等实验研究发现MSCs移植后能够分化成血管内皮细胞，修复受损的肺动脉血管内皮和促进广泛的新生血管网形成，逆转PAH血管重构，有效降低了肺动脉压。3.3MSCs与ALI/ARDSALI/ARDS的主要病理改变为肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞受损，导致其通透性增加，富含蛋白质的液体渗出积聚于肺间质和肺泡。目前众多的研究证明MSCs在ARDS中有积极的保护作用，但是具体的机制仍不是很清楚。因此有学者从其发病机制上推测可能与MSCs可以恢复或改善肺泡上皮细胞对液体的清除能力；促进损伤肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞修复有40 安徽医科大学硕士学位论文[29]关，且相关研究也证实了这种可能性。Lee等研究显示MSCs在内毒素诱导的人肺ARDS模型中，MSCs移植组肺泡清除率显著高于模型中，同时实验进一步证实与MSCs分泌角化细胞生长因子（KFG）；其发挥清除肺泡液体的作用，与上调ENaC基因表达和增强N-K-ATP酶活性密切相关。同时其急性肺水肿模型中[30]亦证实了，KGF可以减轻支气管肺泡灌洗液中蛋白水平和肺水肿的程度。另有研究证实MSCs可分泌肝细胞生长因子（HGF），维持毛细血管内皮和肺泡上皮[31]的膜稳定性，发挥抗细胞凋亡和保护肺组织的作用。3.4MSCs与慢性阻塞性肺疾病慢性阻塞性肺疾病(ChronicObstructivePulmonaryDisease，COPD)是临床常见病，它的发病机制比较复杂，目前的研究已证实COPD的特征性改变为累及气道、肺实质及肺血管的慢性炎症。目前认为COPD属于不可逆性病变，有害因素造成的肺部损伤依靠本身无法达到完全修复，一方面可能与一些致病因素持续存在或原发因素已不存在，但是炎症反应仍继续发展；另一方面可能与肺部组织受到严重损伤，机体自身干细胞，包括损伤局部干细胞，如气管-支气管上皮干细胞、末梢气道干细胞、肺泡上皮细胞，可以通过增殖、分化，补充机体所需的细胞。由于其数量极为有限且常常处于缓慢的细胞周期中，亦或由于龛位遭到破坏使干细胞损伤，导致没有足够的数量用以修复组织；因此外源性输注干细胞或有助于肺部损伤的修复。现有研究发现，经静脉注射进行MSCs移植，由于肺脏的特殊结构，移植的MSC经过血液循环首先[32]将被毛细血管网嵌顿而停留在肺部，一旦MSCs在肺部毛细血管停留，则有机会和微环境和周围组织相互作用，逐步迁移到肺间质、肺泡、气道和肺血管发挥作用。MSCs由于其低表达HLAI、HLAII及共同刺激分子，使其可以逃避机体[33]的免疫监控，从而进一步发挥作用。然而外源性MSCs参与到肺组织损伤修复的具体机制仍不清楚，可能通过以下几个方面。首先，肺部损伤造成的局部微环境改变，可以诱导MSCs向肺部聚集，并向肺泡、肺间质细胞和肺气道上皮细胞[23][34,35]分化。外源性MSCs移植增强肺泡上皮细胞扩增的机制可能与细胞融合和[36]β-连环蛋白信号通道的激活有关。其次与MSC的免疫抑制作用有关，移植的MSC可能通过细胞与细胞间的相互作用或抑制T细胞活化介导的炎症反应中的[37]某一通道而减轻肺部损伤，在内毒素诱导的肺损伤老鼠模型中，干细胞治疗组[38]支气管肺泡灌洗液中炎症细胞因子（IFN-α）与对照组相比明显减低。同时，41 安徽医科大学硕士学位论文有研究显示将MSCs与人支气管粘膜上皮在Transwell体系中进行共同培养，可表[39]达上皮细胞特有的cyotkeartni-18，从而维持支气管粘膜上皮分泌粘液的功能[40]。在COPD的发生、发展过程中，炎症反应占据首要地位，其中最主要的是Th1/Th2免疫反应的失衡，其主要表现为Th1系统的亢进和Th2系统的抑制，其[41]中TNF-α是Th1系统中主要炎症因子，FoschinoBarbaro等研究表明血清、诱导痰及呼出气冷凝液中TNF-α的浓度在COPD患者高于对照组，且最大吸气压、最大呼气压与血清、痰及呼气中冷凝液中的TNF-α浓度成负相关。IL-10是Th2[42]系统中主要抗炎症因子。有研究报道，在COPD患者的痰液中IL-10的比例较对照组有显著的降低。在COPD患者中TNF-α和IL-10的比例失衡，刺激成纤维[43]细胞活化，导致细胞外基质沉积，从而导致肺通气，弥散功能下降。研究表明，BMMSCs可以减少促炎症细胞因子IFN-a和INF-β的表达，所以改善局部炎症的失衡对于COPD的治疗及预防起到关键的作用。众多的动物实验和临床研究数据均表明，干细胞治疗作为一种新的治疗方法，在肺损伤后组织的修复和重建起了很显著的作用。4问题与展望MSCs具有多重分化能力，体外取材、扩增容易，不表达主要组织相容性复合体(MHC)类分子，能够逃避受体的免疫监控，自体移植不产生伦理问题等优点；在体外可以诱导分化为多种组织细胞，使得MSCs成为干细胞研究领域的热点。但是研究也发现MSCs移植的不利方面，如致瘤性，有学者认为可能与干细胞在[44]自我更新中发生基因突变或是增殖分化是被异常号诱导成肿瘤干细胞。此外，目前研究大都限于基础实验，而细胞只有形成组织、器官才可解决临床问题，理论上MSCs虽可分化为肺多级结构，但是具体定向分化机制尚不完全清楚；以及体内如何诱导分化成目的细胞等仍在探索中。总之，MSCs所特有的生物学特性及潜在的能力，已经成为学者研究的焦点之一，对于人类疾病的治疗具有深远的意义，为疾病的治疗提供了一个全新的思路。相信随着对MSCs的特性及定向分化机制的不断深入研究，将对于研究各种组织的发育及疾病的发病机制和治疗等具有重大的意义。参考文献42 安徽医科大学硕士学位论文1.KramperaM,PasiniA,PizzoloG,etal.Regenerativeandimmunomodulatorypotentialofmesenchymalstemcells.CurrOpinPharmacol.2006;6(4):435-41.Review.2.daSilvaMeirellesL,ChagastellesPC,NardiNB.Mesenchymalstemcellsresideinvirtuallyallpost-natalorgansandtissues.JCellSci.2006;119(Pt11):2204-13.3.GangEJ,HongSH,JeongJA,etal.Invitromesengenicpotentialofhumanumbilicalcordblood-derivedmesenchymalstemcells.BiochemBiophysResCommun.2004;321(1):102-8.4.YenBL,HuangHI,ChienCC,etal.Isolationofmultipotentcellsfromhumantermplacenta.StemCells.2005;23(1):3-9.5.CampagnoliC,RobertsIA,KumarS,etal.Identificationofmesenchymalstem/progenitorcellsinhumanfirst-trimesterfetalblood,liver,andbonemarrow.Blood.2001;98(8):2396-402.6.SenB,GuilluyC,XieZ,CaseN,etal.Mechanicallyinducedfocaladhesionassemblyamplifiesanti-adipogenicpathwaysinmesenchymalstemcells.StemCells.2011;29(11):1829-36.7.BarryFP,BoyntonRE,HaynesworthS,etal.ThemonoclonalantibodySH-2,raisedagainsthumanmesenchymalstemcells,recognizesanepitopeonendoglin(CD105).BiochemBiophysResCommun.1999;265(1):134-9.8.BarryF,BoyntonR,MurphyM,HaynesworthS,ZaiaJ.TheSH-3andSH-4antibodiesrecognizedistinctepitopesonCD73fromhumanmesenchymalstemcells.BiochemBiophysResCommun.2001;289(2):519-24.9.MinguellJJ,EricesA,CongetP.Mesenchymalstemcells.ExpBiolMed(Maywood).2001;226(6):507-20.43 安徽医科大学硕士学位论文10.PittengerMF,MackayAM,BeckSC,etal.Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.Science.1999;284(5411):143-7.11.TamuraH,OkamotoS,IwatsukiK,etal.Invivodifferentiationofstemcellsintheaorta-gonad-mesonephrosregionofmouseembryoandadultbonemarrow.ExpHematol.2002;30(8):957-66.12.WoodburyD,SchwarzEJ,ProckopDJ,etal.Adultratandhumanbonemarrowstromalcellsdifferentiateintoneurons.JNeurosciRes.2000;61(4):364-70.13.HouJF,ZhangH,YuanX,etal.Invitroeffectsoflow-levellaserirradiationforbonemarrowmesenchymalstemcells:proliferation,growthfactorssecretionandmyogenicdifferentiation.LasersSurgMed.2008;40(10):726-33.14.Anjos-AfonsoF,SiapatiEK,BonnetD.Invivocontributionofmurinemesenchymalstemcellsintomultiplecell-typesunderminimaldamageconditions.JCellSci.2004;117(Pt23):5655-64.15.WangG,BunnellBA,PainterRG,etal.Adultstemcellsfrombonemarrowstromadifferentiateintoairwayepithelialcells:potentialtherapyforcysticfibrosis.ProcNatlAcadSciUSA.2005;102(1):186-91.16.MajorsAK,BoehmCA,NittoH,etal.Characterizationofhumanbonemarrowstromalcellswithrespecttoosteoblasticdifferentiation.JOrthopRes.1997;15(4):546-57.17.SimonsenJL,RosadaC,SerakinciN,etal.Telomeraseexpressionextendstheproliferativelife-spanandmaintainstheosteogenicpotentialofhumanbonemarrowstromalcells.NatBiotechnol.2002;20(6):592-6.18.SabatiniF,PetecchiaL,TavianM,etal.Humanbronchialfibroblastsexhibitamesenchymalstemcellphenotypeandmultilineagedifferentiatingpotentialities.Lab44 安徽医科大学硕士学位论文Invest.2005;85(8):962-71.19.daSilvaMeirellesL,ChagastellesPC,NardiNB.Mesenchymalstemcellsresideinvirtuallyallpost-natalorgansandtissues.JCellSci.2006;119(Pt11):2204-13.20.LamaVN,SmithL,BadriL,etal.Evidencefortissue-residentmesenchymalstemcellsinhumanadultlungfromstudiesoftransplantedallografts.JClinInvest.2007;117(4):989-96.21.HuaJ,YuH,DongW,YangC,etal.Characterizationofmesenchymalstemcells(MSCs)fromhumanfetallung:potentialdifferentiationofgermcells.TissueCell.2009;41(6):448-55.22.KottonDN,MaBY,CardosoWV,etal.Development.Bonemarrow-derivedcellsasprogenitorsoflungalveolarepithelium.2001;128(24):5181-8.23.OrtizLA,GambelliF,McBrideC,etal.Mesenchymalstemcellengraftmentinlungisenhancedinresponsetobleomycinexposureandamelioratesitsfibroticeffects.ProcNatlAcadSciUSA.2003;100(14):8407-11.24.赵峰,李圣青,逮新宇,等.骨髓间充质干细胞对肺损伤大鼠转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(29):5267-5630.25.HayashidaK,FujitaJ,MiyakeY,etal.Bonemarrow-derivedcellscontributetopulmonaryvascularremodelinginhypoxia-inducedpulmonaryhypertension.Chest.2005;127(5):1793-8.26.ImanishiY,SaitoA,KomodaH,etal.Allogenicmesenchymalstemcelltransplantationhasatherapeuticeffectinacutemyocardialinfarctioninrats.JMolCellCardiol.2008;44(4):662-71.45 安徽医科大学硕士学位论文27.BadilloAT,ReddenRA,ZhangL,etal.Treatmentofdiabeticwoundswithfetalmurinemesenchymalstromalcellsenhanceswoundclosure.CellTissueRes.2007;329(2):301-11.28.何志旭，汪浩文，尚峰等.骨髓间充质干细胞治疗实验性肺动脉高压大鼠的疗效观察.贵阳医学院学报.2008;33(6):567-572.29.LeeJW,FangX,GuptaN,etal.AllogeneichumanmesenchymalstemcellsfortreatmentofE.coliendotoxin-inducedacutelunginjuryintheexvivoperfusedhumanlung.ProcNatlAcadSciUSA.2009;106(38):16357-62.30.LeeJW,GuptaN,SerikovV,etal.Potentialapplicationofmesenchymalstemcellsinacutelunginjury.ExpertOpinBiolTher.2009;9(10):1259-70.31.LiuXL,SatoS,DaiW,YamanakaN.Theprotectiveeffectofhepatocytegrowth-promotingfactor(pHGF)againsthydrogenperoxide-inducedacutelunginjuryinrats.MedElectronMicrosc.2001;34(2):92-102.32.FischerUM,HartingMT,JimenezF,etal.Pulmonarypassageisamajorobstacleforintravenousstemcelldelivery:thepulmonaryfirst-passeffect.StemCellsDev.2009;18(5):683-92.33.DominiciM,LeBlancK,MuellerI,etal.Minimalcriteriafordefiningmultipotentmesenchymalstromalcells.TheInternationalSocietyforCellularTherapypositionstatement.Cytotherapy.2006;8(4):315-7.34.HackettTL,ShaheenF,JohnsonA,etal.Characterizationofsidepopulationcellsfromhumanairwayepithelium.StemCells.2008;26(10):2576-85.Epub2008Jul24.35.FerrandJ,NoëlD,LehoursP,eral.Humanbonemarrow-derivedstemcellsacquireepithelialcharacteristicsthroughfusionwithgastrointestinalepithelialcells.PLoSOne.2011;6(5):e19569.46 安徽医科大学硕士学位论文36.ZhangY,GossAM,CohenED,etal.AGata6-Wntpathwayrequiredforepithelialstemcelldevelopmentandairwayregeneration.NatGenet.2008;40(7):862-70.37.NoëlD,DjouadF,BouffiC,MrugalaD,etal.Multipotentmesenchymalstromalcellsandimmunetolerance.LeukLymphoma.2007;48(7):1283-9.38.GuptaN,SuX,PopovB,etal.Intrapulmonarydeliveryofbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsimprovessurvivalandattenuatesendotoxin-inducedacutelunginjuryinmice.JImmunol.2007;179(3):1855-63.39.WangG,BunnellBA,PainterRG,etal.Adultstemcellsfrombonemarrowstromadifferentiateintoairwayepithelialcells:potentialtherapyforcysticfibrosis.ProcNatlAcadSciUSA.2005;102(1):186-91.40.LeVisageC,DunhamB,FlintP,etal.Cocultureofmesenchymalstemcellsandrespiratoryepithelialcellstoengineerahumancompositerespiratorymucosa.TissueEng.2004;10(9-10):1426-35.41.FoschinoBarbaroMP,CarpagnanoGE,etal.Inflammation,oxidativestressandsystemiceffectsinmildchronicobstructivepulmonarydisease.IntJImmunopatholPharmacol.2007;20(4):753-63.42.TakanashiS,HasegawaY,KanehiraY,etal.Interleukin-10levelinsputumisreducedinbronchialasthma,COPDandinsmokers.EurRespirJ.1999;14(2):309-14.43.PrasannaSJ,GopalakrishnanD,ShankarSR,etal.Pro-inflammatorycytokines,IFNgammaandTNFalpha,influenceimmunepropertiesofhumanbonemarrowandWhartonjellymesenchymalstemcellsdifferentially.PLoSOne.2010;5(2):e9016.44.SellS.Stemcelloriginofcanceranddifferentiationtherapy.CritRevOncolHematol.2004;51(1):1-28.47
