广西地区hiv-1流行亚型、基因变异性分析及耐药突变的实验研究

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1、浙江大学博士学位论文广西地区HIV--1流行亚型、基因变异性分析及耐药突变的实验研究姓名：齐海燕申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：于晓方；徐荣臻20120531广西地区HIV-1流行亚型、基因变异性分析及耐药突变的实验研究浙江大学医学院博士研究生导师肿瘤学齐海燕于晓方教授中文摘要艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征(Acquiredimmunodefieiencysyndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(H1lmanimmunodeficiencyvirus，HIV)引起的一种免疫缺陷性疾病．人体感染艾滋病毒后，机体免疫功能逐渐降低，最后因为各种机会性感染而导致死亡．自19

2、85年发现首例HIV-1感染者以来，艾滋病快速蔓延已经成为全球瞩目的问题．2009年数据显示，艾滋病流行至今，全球大约已有6000万人感染了艾滋病病毒，其中有2500万人死于该疾病．在中国，艾滋病也呈加速流行和蔓延的趋势．根据中国卫生部、联合国艾滋病规划署(UNAIDS)和世界卫生组织(WHO)联合公布的2011年中国艾滋病疫情数据显示，截至2011年底，中国艾滋病病毒感染者和艾滋病病人(PLHIV)总共78万。中国已经成为艾滋病流行大国。广西省由于其特殊的地理位置，一直是艾滋病流行较早及较为严重的城市．因此，有效地预防和治疗艾滋病已成为当务之急．本实验收集了2008-2010年广

3、西北海、百色、南宁三个地区静脉吸毒人群67例，分别对Gag／Pol及Env基因进行扩增，并对该地区主要流行毒株亚型特征、基因变异及耐药突变做出了详细分析．本研究分为以下三个部分：Ⅱ第一部分广西地区HIV．1流行亚型分析本部分实验旨在了解我国广西地区HIV-1毒株亚型的流行状况，我们于2008至2010年分别在百色、南宁、北海等地区采集了67例HW-1阳性标本，经巢式PCR扩增、纯化，测序，得到的序列用DNASIS软件进行编辑、校正后，使用Clustalw软件与美国LosAlamosNationalLaboratoryHWSequcnceDatabaseH1V核酸序列库提供的参考序列

4、进行比较，利用Mcga5软件中Neighbor-joining(N-J)method进行系统进化树的构建。使用Bootstrap对neighbor-joining系统树和数枝形状的可信性进行检验，重复1000次．67例Gag．Pol序列与国际各亚型标准序列进行系统进化树分析显示，在广西省不同地区，由于HIV-I传播的来源不同，使得HIV．1亚型复杂多样．在北海地区的25例标本中，14例为CRF08BC(56．0％)，9侧为CRF01AE(36．O％)，2例是CRF07BC(8．O％)．南宁地区21例标本中，16例为CRF08BC(76．19％)，3例为CRF01AE14．28％)，

5、剩余2例为CRF07BC(9．52％)．值得注意的是我们检测的百色2l例标本中，只发现了CRF08BC这种重组毒株．说明这种亚型可能是百色静脉吸毒人群中HIV．1流行的主要毒株．其中被确定为CRF07BC亚型的4个序列中，P6domain均发现有7个氨基酸的缺失，但其生物学意义还不是十分清楚．追踪HW-1传播路线时我们发现，云南是我国HIV．1感染最早的城市之一，该地区的主要流行毒株是CRF08BC，而且百色与云南地理位置较为接近，所以我们有理由相信HW-1的传播路线就是从云南省到广西省这样一个与毒品交易相符的传播过程。随着广西省从西向南地理位置的迁移，我们发现，主要感染人群的CR

6、F08BC重组毒株的比例在逐渐下降，而CRF01AE重组毒株的比例却在逐渐上升．给我们展现出两种完全不同的重组形式在地域分布上的特点．HI第二部分HIV-1基因变异分析本部分我们比对了采集标本中亚型为CRF08一BC的所有序列，(通过Gag．Pol序列建立的系统进化树确定)分析24条EnvlopeC2V4区氨基酸序列未发现重排及终止码子，能翻译成正确的氨基酸阅读框架．在HIV-1的5个可变区中，氨基酸变异主要发生在V4区和C3区，V3区氨基酸序列则表现的比较保守。在24个序列中除了BS079、NN002、BH074、及NN025这四个序列，其余序列均发现高度保守的十二肽段1LIGP

7、CK2TFYATG．这个特殊的结构以前也有过报道．在我们对序列的分析中发现BH074，及NN025这两个序列中包含了不确定的氨基酸“X”，但是实际上这些位点的氨基酸可能与参考序列的氨基酸是相同的．但在V4loop中我们就没有发现这样类似的氨基酸片段．我们把本实验的序列，与本课题组以前研究的2000年广西地区的32例标本序列做了氨基酸比对发现，在整个C2-V4区，除了恒定区C2变异度较低外，其它V3、C3、V4区氨基酸突变率均较高．总体分析显示与97CNGX-7F参考序