tgf-β1、bfgf和pdgf在奶牛乳腺纤维化中作用的研究

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1、分类号S852.3学校代码10129UDC11.220学号2009301024TGF-β1、bFGF和PDGF在奶牛乳腺纤维化中作用的研究StudiesontheEffectofTGF-β1,bFGFandPDGFinBovineMammaryFibrosis申请人：丁旭娜学科门类：农学学科专业：基础兽医学研究方向：动物传染病与免疫病理学指导教师：王凤龙教授论文提交日期：二〇一二年四月摘要奶牛乳腺纤维化主要是由乳腺炎引起的一种常见的病理过程，而乳腺炎是奶牛的主要疾病之一，其发病率和感染率在国内外均较高，可引起奶牛乳腺不同程度的纤维化过程。纤维化的乳腺泌乳量降低，严重时可发展为乳腺硬化

2、导致奶牛淘汰，给奶牛业造成严重的损失。组织器官的纤维化过程主要取决于细胞外基质（ECM）的沉积、分解和相关细胞凋亡等方面，并与转化生长因子-β（TGF-β）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和血小板源性生长因子（PDGF）等多种细胞因子密切相关。目前关于肝脏和肾脏等组织纤维化的研究较多，而有关乳腺纤维化的研究较少，在乳腺纤维化过程中除间质成纤维细胞产生ECM外，乳腺上皮细胞是否能转分化为肌成纤维细胞（MFB）而产生ECM仍不明确。α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），结缔组织生长因子（CTGF）和胶原Ⅰ（COLⅠ）是判断组织纤维化程度的主要指标，因此可通过检测此三项指标表达量的变化，以

3、确定细胞因子在纤维化过程中的作用。为在体外培养纯化出稳定生长的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞，通过外科手术的方法采取妊娠后期或泌乳期的荷斯坦奶牛乳腺组织，分离乳腺腺泡，用组织块培养法体外培养奶牛乳腺细胞，应用差时胰酶消化法和差速贴壁法将奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞两种细胞分别纯化出来，并用免疫组化的方法对细胞的纯度进行鉴定。将不同浓度的TGF-β1（0，1，5，10ng/ml）、bFGF（0，5，10，20ng/ml）和PDGF-BB（0，5，10，20ng/ml）三种外源性细胞因子分别作用于体外培养的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞，于不同的时间点（12h，24h，48h，72h）提取细

4、胞的总RNA和总蛋白，以β-actin作为内参基因，用Real-TimeRT-PCR方法测定两种细胞中α-SMA、CTGF和COLⅠα1mRNA相对表达量的变化，其PCR产物进行测序分析；并用Westernblot方法测定相应蛋白的表达。研究结果表明：纯化的奶牛乳腺上皮细胞多为多角形，细胞核圆形或椭圆形，核仁清晰可见，多成鹅卵石样或铺路石样生长，并可分泌乳滴，角蛋白-18反应阳性，波形蛋白反应阴性；纯化的奶牛乳腺成纤维细胞多为长梭形，成旋涡状或放射状生长，角蛋白-18反应阴性，波形蛋白反应阳性。经纯化后两种细胞的纯度均可达95%以上，可满足后续试验的要求；外源性TGF-β1能够有效上

5、调体外培养的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞中α-SMA、CTGF和COLⅠα1mRNA及α-SMA蛋白的表达，并成一定的量效关系；外源性bFGF对体外培养奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞CTGFmRNA的表达起促进作用，对成纤维细胞COLⅠα1mRNA的表达主要起促进作用，对奶牛乳腺上皮细胞COLⅠα1mRNA表达的作用不明显，高浓度的bFGF对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞α-SMAmRNA的表达均有抑制趋势，与α-SMA蛋白表达的结果不是很一致。外源性PDGF-BB对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞CTGF和COLⅠα1mRNA的表达主要起促进作用；对奶牛乳腺成纤维细胞α-SMA蛋白的表达起

6、促进作用，较低浓度时对奶牛乳腺成纤维细胞α-SMAmRNA的表达起促进作用；而高浓度时对奶牛乳腺上皮细胞α-SMAmRNA的表达有抑制趋势，与α-SMA蛋白表达的结果不是很一致。经测序分析，奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞中目的基因CTGF、α-SMA和COLⅠα1的扩增产物序列一致，且通过比对分析得出其扩增产物均为牛的CTGF、α-SMA和COLⅠα1。研究证实：组织块培养法结合应用差时胰酶消化法和差速贴壁法能够在体外培养并纯化出稳定生长的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞两种细胞。外源性TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞α-SMA、CTGF和COLⅠα1的mRNA及α-SMA蛋白的

7、表达均具有促进作用，表明TGF-β1能够促进奶牛乳腺上皮细胞转分化和细胞外基质的产生。外源性bFGF对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞CTGFmRNA的表达起促进作用；对成纤维细胞COLⅠα1mRNA的表达主要起促进作用，对奶牛乳腺上皮细胞COLⅠα1mRNA表达的作用不明显；高浓度的bFGF对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞α-SMAmRNA的表达均有抑制趋势。外源性PDGF-BB对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞CTGF和COLⅠα1mRNA的表达主要起促进作用；