全反式维甲酸联合替莫唑胺对u251细胞增殖和凋亡作用的实验研究

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1、硕士学位论文lIIIIIIllllllllllllllllllllllllllIIIIIY2406586全反式维甲酸联合替莫唑胺对U251细胞增殖和凋亡作用的实验研究，硕士研究生：吴长松指导教师：徐国政摘要背景：化疗是治疗脑胶质瘤(Glioma)重要的辅助治疗方法之一，但目前胶质瘤化疗所使用药物种类有限。口服烷化剂替莫唑胺(temozolomide，n腥)生物相容性好，能够透过血脑屏障，是目前临床上最常应用的抗胶质瘤药物，是治疗胶质瘤首选的标准化疗药。TMZ进入人体后分解为5一氨基一眯唑一4一酰胺(AIC)与重氮甲烷，即活性的烷基化物质，产生

2、细胞毒性作用，使细胞DNA中鸟嘌呤的N7和06位置上发生甲基化，在DNA复制过程中，错配修复系统不能为第6位氧原子甲基鸟嘌呤找到配对碱基，导致子链DNA中有缺口形成。缺口随细胞分裂而逐渐积累，最终阻碍复制启动，从而使细胞停滞在(32／M期，细胞发生凋亡。但是这种作用机制会被胶质瘤细胞内的耐药相关蛋白06_1手1基鸟嘌呤．DNA．甲基转移酶(MGMT)所逆转，MGMT能修复烷化剂导致的DNA烷基化损伤，这是胶质瘤细胞对亚硝脲类药物及TMZ产生耐药的主要原因，从而限制了TMZ的抗肿瘤作用。如何运用化疗增敏剂提高TMZ对恶性胶质瘤的细胞毒作用是近年

3、来研究的一个热点。全反式维甲酸(a11．transretinoicacid，A职A)是一种天然诱导剂，能诱导细胞分化、抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡从而具有抗肿瘤作用，已在造血系统肿瘤及其他实体肿瘤(肝癌、肺癌、直肠癌、乳腺癌等)显示出其抗肿瘤作用。尤其是用ATRA治疗急性早幼粒细胞性白血病效果确切，可诱导完全缓解。有研究表明，ATRA对C6胶质瘤细胞的增殖具有抑制作用，且抑制率随ATRA浓度和处理时间的延长而增加，具有时间和浓度的依赖性。作为一种脂溶性化合物，ATRA可以通过血脑屏障，并在脑组织内浓集，这是其可用于治疗脑胶质瘤的基础。目前，

4、维甲酸对胶质瘤作用机理还摘要不完全清楚，它涉及到与增殖、分化、凋亡调节有关的一整个网络系统。目前关于ATRA在治疗胶质瘤方面报道不多，单独应用时其抗肿瘤作用有限，但有报道证明其通过诱导细胞分化及抑制增殖，可增加其他化疗药物如紫杉醇、柔红霉素及Y．干扰素等对胶质瘤细胞毒作用的敏感性。本实验以人胶质瘤细胞株U251为实验模型，将ATRA作为TMZ抗肿瘤作用的增敏剂，观察ATRA与TMZ联合作用对U251细胞的生长抑制是否存在协同作用，ATRA是否对TMZ诱导的凋亡效应具有增敏作用，并通过检测与细胞分化和凋亡相关的调控蛋白及细胞表型分子，如CDl3

5、3表型、Bcl-2、BAX、caspase．3、caspase．8、caspase．9等凋亡蛋白的表达情况初步分析其可能的作用机制，为克服胶质瘤细胞对TMZ耐药、提高TMZ体外抗胶质瘤作用的进一步研究提实验基础。方法：1、细胞培养：胶质瘤细胞株U251在含10％胎牛血清(Fetalbovineserum，FBS)的DMEM／F)2培养基中于37℃、5％C02培养箱中培养，隔1-2天换液一次，4-5天传代一次。取对数生长期细胞进行实验。2、M11：'}去检测细胞增殖抑制率：取对数生长期的细胞，胰酶消化后混悬，细胞计数后调整细胞浓度，接种于96孔

6、板，每孔100山，含5x103个细胞。设对照组、ATRA设10、20、30、40mM的浓度，TMZ设100、200、300、400raM的浓度，每组4个复孔。每次实验共种植5个板，置于5％C02、37℃恒温培养箱中培养，分别于培养24、48、72、96、120h后弃上清，加入相应浓度的药物，对照组加入相应浓度的二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。每板加药后置于5％C02、37"C培养箱中继续孵育24h后行MTT比色实验，加入MTT(59／L)2opJ，孵箱培育4h，弃上清，加入150tdDMSO，摇床振荡10rain，

7、酶标仪490啪测OD值。绘制生长抑制曲线图，并做统计学分析。根据上述实验结果，选取ATRA浓度为20mM培养48h，弃上清，再加入浓度为TMZ200mM培养48h后，行M兀检测细胞增殖抑制率，并与两药相同浓度作用48h后的抑制率比较。计算细胞生长抑制率％F(1一实验组OD值／对照组OD值)x100％。3、分组及药物干预：设空白对照组(等量DMEM／F12培养基加等量DMSO)、ATRA组(20raM)、TMZ组(200mM)、联合作用组(ATRA浓度为20mM+TMZ浓度为200raM)。两药单用组分别按上述分组加入各药作用Ⅱ硕士学位论文48

8、h；而联合用药采用序贯加药的方法，先】JHATRA(20mM)作用48h，再弃去培养基，加入TMZ(200mM)作用48h。4、划痕实验及细胞形态学变化：以ATRA