全反式维甲酸联合替莫唑胺对u251细胞增殖和凋亡作用的实验研究

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文全反式维甲酸联合替莫唑胺对U251细胞增殖和凋亡作用的实验研究ExperimentalResearchofCellProliferationandApoptosisofAH-transRetinoicAcidCombinedwithTemozolomideonU251GliomaCellLine课题来源：导师指定课题学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院吴长松徐国政教授外科学(神经外科)专业型硕士第一临床医学院2013年3月20日武汉硕士学位论文lIIIIIIllllllllllllllllllllllllllIII

2、IIY2406586全反式维甲酸联合替莫唑胺对U251细胞增殖和凋亡作用的实验研究，硕士研究生：吴长松指导教师：徐国政摘要背景：化疗是治疗脑胶质瘤(Glioma)重要的辅助治疗方法之一，但目前胶质瘤化疗所使用药物种类有限。口服烷化剂替莫唑胺(temozolomide，n腥)生物相容性好，能够透过血脑屏障，是目前临床上最常应用的抗胶质瘤药物，是治疗胶质瘤首选的标准化疗药。TMZ进入人体后分解为5一氨基一眯唑一4一酰胺(AIC)与重氮甲烷，即活性的烷基化物质，产生细胞毒性作用，使细胞DNA中鸟嘌呤的N7和06位置上发生甲基化，在DNA复制过程中，错配修复系统不能为第

3、6位氧原子甲基鸟嘌呤找到配对碱基，导致子链DNA中有缺口形成。缺口随细胞分裂而逐渐积累，最终阻碍复制启动，从而使细胞停滞在(32／M期，细胞发生凋亡。但是这种作用机制会被胶质瘤细胞内的耐药相关蛋白06_1手1基鸟嘌呤．DNA．甲基转移酶(MGMT)所逆转，MGMT能修复烷化剂导致的DNA烷基化损伤，这是胶质瘤细胞对亚硝脲类药物及TMZ产生耐药的主要原因，从而限制了TMZ的抗肿瘤作用。如何运用化疗增敏剂提高TMZ对恶性胶质瘤的细胞毒作用是近年来研究的一个热点。全反式维甲酸(a11．transretinoicacid，A职A)是一种天然诱导剂，能诱导细胞分化、抑制细

4、胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡从而具有抗肿瘤作用，已在造血系统肿瘤及其他实体肿瘤(肝癌、肺癌、直肠癌、乳腺癌等)显示出其抗肿瘤作用。尤其是用ATRA治疗急性早幼粒细胞性白血病效果确切，可诱导完全缓解。有研究表明，ATRA对C6胶质瘤细胞的增殖具有抑制作用，且抑制率随ATRA浓度和处理时间的延长而增加，具有时间和浓度的依赖性。作为一种脂溶性化合物，ATRA可以通过血脑屏障，并在脑组织内浓集，这是其可用于治疗脑胶质瘤的基础。目前，维甲酸对胶质瘤作用机理还摘要不完全清楚，它涉及到与增殖、分化、凋亡调节有关的一整个网络系统。目前关于ATRA在治疗胶质瘤方面报道不多，单独应用时

5、其抗肿瘤作用有限，但有报道证明其通过诱导细胞分化及抑制增殖，可增加其他化疗药物如紫杉醇、柔红霉素及Y．干扰素等对胶质瘤细胞毒作用的敏感性。本实验以人胶质瘤细胞株U251为实验模型，将ATRA作为TMZ抗肿瘤作用的增敏剂，观察ATRA与TMZ联合作用对U251细胞的生长抑制是否存在协同作用，ATRA是否对TMZ诱导的凋亡效应具有增敏作用，并通过检测与细胞分化和凋亡相关的调控蛋白及细胞表型分子，如CDl33表型、Bcl-2、BAX、caspase．3、caspase．8、caspase．9等凋亡蛋白的表达情况初步分析其可能的作用机制，为克服胶质瘤细胞对TMZ耐药、提

6、高TMZ体外抗胶质瘤作用的进一步研究提实验基础。方法：1、细胞培养：胶质瘤细胞株U251在含10％胎牛血清(Fetalbovineserum，FBS)的DMEM／F)2培养基中于37℃、5％C02培养箱中培养，隔1-2天换液一次，4-5天传代一次。取对数生长期细胞进行实验。2、M11：'}去检测细胞增殖抑制率：取对数生长期的细胞，胰酶消化后混悬，细胞计数后调整细胞浓度，接种于96孔板，每孔100山，含5x103个细胞。设对照组、ATRA设10、20、30、40mM的浓度，TMZ设100、200、300、400raM的浓度，每组4个复孔。每次实验共种植5个板，置于

7、5％C02、37℃恒温培养箱中培养，分别于培养24、48、72、96、120h后弃上清，加入相应浓度的药物，对照组加入相应浓度的二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。每板加药后置于5％C02、37"C培养箱中继续孵育24h后行MTT比色实验，加入MTT(59／L)2opJ，孵箱培育4h，弃上清，加入150tdDMSO，摇床振荡10rain，酶标仪490啪测OD值。绘制生长抑制曲线图，并做统计学分析。根据上述实验结果，选取ATRA浓度为20mM培养48h，弃上清，再加入浓度为TMZ200mM培养48h后，行M兀检测细胞增殖抑制率，并与两药相同

8、浓度作用48h后的抑制率